牛糞高溫堆制過程中細菌和真菌多樣性變化分析

岳壽松，張玉鳳，邊斐，張燕，陳高，朱友峰，王翠萍

（1.山東省農業科學院生物技術研究中心，山東 濟南 250100；2.山東省農業科學院農業資源與環境研究所，山東 濟南 250100）

畜禽糞便是規?；B殖業的主要廢棄物，處理不當會成為重要的環境污染源。高溫堆制是糞便無害化轉化的重要途徑［1-3］。堆肥腐熟主要是由微生物參與的生理生化過程，在微生物驅動下，完成畜禽糞便有機質的生物降解和轉化［4］。相對于自然發酵，通過添加篩選的功能菌可以改善堆肥中原始微生物種群結構，促進木質纖維素降解，顯著加快堆肥腐熟進程，縮短發酵周期并提高降解效率［5，6］。

微生物多樣性變化是糞便高溫堆制不同階段的重要特征。研究堆肥過程中微生物群落代謝特征，對揭示有機物降解機制及堆肥條件的優化具有重要理論意義和實踐價值。王秀紅等［7］利用宏基因組技術研究了好氧堆肥細菌群落結構，發現細菌菌群的種類和豐度存在多樣性。方華舟等［8］利用平板培養法研究牛糞好氧堆肥期間微生物特點，發現細菌是發酵過程中的優勢微生物，中溫性細菌是升溫階段主要作用菌群，嗜熱放線菌及嗜熱細菌是高溫階段優勢菌群，霉菌是降溫階段優勢菌群。王亮［9］研究表明，牛糞自然好氧發酵過程中細菌類是優勢菌群，多樣性指數大于2.1；真菌類微生物在降溫期持續增加，是中后期的優勢群體，對纖維素分解起決定性作用。

已有研究大都利用傳統培養方法，或利用DGGE及高通量測序技術，分別對細菌或真菌進行分析，對高溫堆肥過程中細菌和真菌群落聯合分析、系統研究報道較少。本研究采用高通量測序技術，分析牛糞高溫堆肥過程中不同階段物料中細菌和真菌種類與相對豐度變化及演替特點，對于理解牛糞堆肥過程、提高堆肥效果、開發新型堆肥菌劑均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

堆肥材料：新鮮牛糞、玉米秸稈粉和糠醛渣。微生物發酵菌由山東省農業科學院生物技術研究中心研制，主要成分為枯草芽孢桿菌和米曲霉孢子混合物，活菌和孢子含量100億/克。添加量為每噸物料500克。試驗材料基本理化性質見表1。發酵物料碳氮比（C/N）調整為30∶1，初期含水量為60%，pH值7.2。

表1 堆肥材料的基本理化性質

1.2 試驗方法

采用槽式發酵工藝。玉米秸稈粉碎長度小于2 cm，糞便與粉碎好的輔料混合，調節水分至60%，加入微生物接種劑，充分攪拌混勻，送至發酵槽中。堆成高1.2 m、寬2 m、長3 m的條垛，3次重復。

每天上午9∶30—10∶30測定條垛表層下30 cm溫度，同時記錄周圍環境溫度。物料溫度高于60℃進入高溫期，每2天翻堆，維持溫度70℃左右；物料溫度下降到50℃以下，停止翻堆，進入降溫期；物料溫度降到略高于環境溫度為熟化期。分別于升溫期（IM，物料入發酵池1～3 d）、高溫期（TH）、降溫期（CO）、熟化期（MA）進行取樣。取樣方法：于每個條垛表層下30 cm取5個點，混合均勻；3個重復的樣品再次混合均勻，立即置于-18℃冰柜保存。

1.3 DNA提取與測序

采用深圳華大基因科技有限公司Illumina平臺Hiseq進行16S rRNA和ITS測序（pairedend）。提取樣品基因組DNA，對檢測合格的樣品構建文庫。設計合成含有測序接頭的雙index融合引物，以基因組DNA為模板，進行融合引物PCR，磁珠篩選目的amplicon片段，用合格的文庫進行cluster制備和測序。用下機得到的數據進行相應的生物信息分析。下機數據濾除低質量的reads，剩余高質量的clean data用于后期分析；通過reads之間的overlap關系將reads拼接成tags；拼接的tags經過優化后，在97%相似度下用QIIME軟件將其聚類為用于物種分類的OTU（operational taxonomic units），利用QIIME軟件計算樣品Chao1指數、Shannon指數、phylogenetic diversity（譜系多樣性）的alpha多樣性值，經過UniFrac算法利用系統進化信息比較樣品間物種群落差異［10，11］。

2 結果與分析

2.1 物種分類和相對豐度分析

2.1.1 OTU數及相對豐度分析 OTU代表樣品物種豐富程度。細菌16S rRNA測序結果（表2）顯示，升溫期（IM）、高溫期（TH）、降溫期（CO）和熟化期（MA）樣本共產生965個OTU。CO期和MA期細菌物種豐富度比IM期和TH期高80%以上，說明物料經高溫轉化后，更有利于細菌的生長和繁殖。

真菌ITS測序結果（表2）顯示，IM、TH、CO和MA期樣本共產生164個OTU。TH期比IM期的OTU數增加了29.2%，MA期比CO期增加31.1%。說明高溫伴隨真菌相對豐度的增加，而在熟化期真菌物種相對豐度又有較大幅度增加，與細菌表現明顯不同。

表2 不同發酵時期樣品OTU數

2.1.2 Core-Pan OTU分析 利用Core-Pan OTU分析，統計樣品間或組間共有和特有OTU數目。16S rRNA各時期共有的OTU個數為290，占樣品總OTU數的30.1%；IM 期特有的OTU 31個、TH 期9個、CO期58個、MA期42個（圖1A）。ITS各時期共有的OTU個數為21個，占樣品總數的12.8%。IM期特有的OTU 11個、TH期28個、CO期7個、MA期26個（圖1B）。上述結果表明，細菌與真菌的多樣性和演替模式不同，細菌共有的OTU占總數量的比例較高，特有的OTU相對較少，說明細菌種群相對穩定；真菌共有的OTU占總數量的比例較低，各時期特有的OTU個數相對較多，說明伴隨物料高溫堆制進程，真菌種群演替更劇烈。

圖1 不同時期的Core-Pan OTU圖

2.1.3 微生物種群多樣性差異 Chao1指數越大說明物種總數越多，Shannon指數越大說明物種多樣性越高，Simpson指數越大物種多樣性越低。16S rRNA測序結果（表3）表明，CO期和MA期的Chao1指數和Shannon指數比IM期和TH期高，Simpson指數較低，表明物料經過高溫發酵，細菌的物種數量增加，且種類更豐富。

表3 不同發酵時期樣品16S rRNA和ITS種群多樣性

ITS測序結果（表3）表明，TH 期、MA期Chao1指數比IM期和CO期高，表明高溫期和熟化期真菌的物種數量增加。TH期和MA期Shannon指數也增加，說明高溫期和熟化期具有更高的真菌物種多樣性。真菌種群數量的增加是物料溫度升高的重要影響因子，熟化期間豐富的養分可能更有利于真菌生長，從而增加了真菌的相對豐度。

2.2 物種注釋及其相對豐度分析

2.2.1 門水平群落組成分析 IM期、TH期細菌優勢菌門（相對豐度大于1%）均有4種，各菌門的相對豐度不同；CO期和MA期細菌優勢菌門明顯增多，分別為9種和8種，說明降溫期和熟化期細菌多樣性增加。與IM期相比，TH期、CO期和MA期Actinobacteria（放線菌門）相對豐度大幅度提高，分別提高14.8、7.4、22.8個百分點；Bacteroidetes（擬桿菌門）和Firmicutes（厚壁菌門）相對豐度明顯降低，Bacteroidetes相對豐度分別降低13.8、20.5、20.6個百分點，Firmicutes相對豐度分別降低8.7、10.0、12.0個百分點（表4）。放線菌在堆肥高溫期是分解木質素、纖維素的優勢菌群［12］。擬桿菌屬是糞便中的主要微生物，其相對豐度降低，說明糞便經高溫發酵轉化成腐殖質，與其生境轉化有關。

表4 細菌門水平優勢菌群

真菌ITS測序結果（表5）表明，TH期、CO期和MA期的Ascomycota（子囊菌門）相對豐度均比IM大幅度增加，分別增加30.8、71.6、61.7個百分點。TH期的Zygomycota（接合菌門）和Basidiomycota（擔子菌門）相對豐度比IM亦有大幅度增加，分別增加33.4、9.4個百分點。Ascomycota、Basidiomycota在自然界中與動植物殘體如木材、食品、皮革等腐解有關，Zygomycota可以產生豐富的酶和代謝產物［13-15］。高溫期子囊菌門、接合菌門和擔子菌門相對豐度大幅度提高對物料快速腐解具有重要作用。

表5 真菌門水平優勢菌群

2.2.2 屬水平群落組成分析 各時期優勢細菌群（相對豐度大于1%）數量不同，IM 期和CO期均有14個屬，MA期13個屬，TH期10個屬（表6），各時期優勢菌群種類差異很大。IM期的有害致病菌包括Pedobacter（土地桿菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Psychrobacter（嗜冷桿菌屬）等，其相對豐度很高，可能是未腐熟的糞便中自然存在的。TH期、CO期和MA期上述菌群大幅度下降或消失，說明高溫過程實現了物料無害化。TH期與IM 期比較，Sphingobacterium（鞘氨醇桿菌屬）、Pseudoxanthomonas（假黃色單胞菌屬）、Thermovum（嗜熱菌屬）和Bacillus（芽孢桿菌屬）相對豐度大幅度提高，表現出明顯的產熱和物質轉化特點。與IM期比較，CO期和MA期優勢菌群除Pseudoxanthomonas大幅度升高外，還有高豐度的Actinomadura（放線菌屬）和Streptomyces（鏈霉菌屬），均為生境中重要的微生物，能產生酶、維生素和有機酸等，可促進有機物質降解轉化和增加土壤養分［12、16］。

與IM期相比，TH期真菌屬的優勢菌明顯增多，其次是MA期（表7）。TH期和MA期優勢菌群包含產生高溫和物質轉化功能的菌，如引起多種物質降解和霉腐功能的Aspergillus（曲霉屬），具有降解纖維素和生防功能的Chaetomium（毛殼屬），能產生熱穩定的纖維素酶、半纖維素酶、木質素酶、淀粉酶的Humicol a（腐質霉屬），糞便常分離到的具有腐生功能的Ascobolus（糞盤菌屬），具有漆酶分泌功能的Coprinopsis（鬼傘屬）等，在牛糞和秸稈高溫腐熟過程中均具有重要作用［17-19］。

2.3 菌群結構的聚類（熱圖）分析

2.3.1 門水平聚類分析 利用熱圖對不同時期物料細菌和真菌群落組成進行相似性和差異性分析。細菌門水平物種熱圖（圖2A）表明，IM 期和TH期物種組成和相對豐度最相似，CO期和MA期物種組成和相對豐度最相似。說明細菌菌群演替明顯分為兩個階段。真菌門水平物種熱圖（圖2B）表明，CO期和MA期物種組成和相對豐度最相似（距離最近、枝長最短），TH期與其它階段的物種組成和相對豐度差異很大。

表6 細菌屬水平優勢菌群

表7 真菌屬水平優勢菌群

2.3.2 屬水平聚類分析 細菌屬水平物種熱圖（圖3A）表明，CO期與MA期物種組成和相對豐度最相似（距離最近、枝長最短），TH期與其它階段的物種組成和相對豐度差異很大。真菌屬水平物種熱圖（圖3B）表明，MA期與CO期物種組成和相對豐度最相似（距離最近、枝長最短），TH期與IM期物種組成和相對豐度最相似。

圖2 細菌（A）和真菌（B）門水平物種相對豐度熱圖

圖3 細菌（A）和真菌（B）屬水平物種相對豐度熱圖

3 討論與結論

本試驗采用高通量測序技術研究了添加功能菌劑條件下牛糞高溫堆制過程中細菌和真菌的種群變化。16S rRNA測序結果表明，4個階段樣本共產生965個OTU；ITS測序結果表明，4個階段樣本共產生164個OTU。細菌OTU數量為真菌的5.9倍，表明牛糞高溫堆制期間細菌為主導菌群。細菌OTU分析結果表明，降溫期（CO）和熟化期（MA）細菌物種數量和種類比升溫期（IM）及高溫期（TH）明顯提高，說明物料經高溫后更有利于細菌的生長繁殖。真菌TH期和MA期種類和數量比IM期和CO期多，說明細菌和真菌的演替模式不同。高溫期真菌數量和種類大幅度增加，其菌絲的物理作用以及各種胞外酶均會促進堆肥的發酵［15］。熱圖分析表明，細菌屬水平CO期和MA期聚為一簇，真菌表現了相同的結果。說明進入降溫期和熟化期物種趨于相對穩定。研究還發現，細菌各時期共有的OTU占總數量的比例為30.1%，而真菌共有的OTU占總數量的比例為12.8%，說明不同堆制階段細菌種群相對穩定，真菌種群演替更劇烈。

細菌高溫期的優勢菌群組成有明顯特點，Sphingobacterium（鞘氨醇桿菌屬）、Pseudoxanthomonas（假黃色單胞菌屬）、Bacillus（芽孢桿菌屬）、Thermovum（嗜熱菌屬）相對豐度大幅度提高。鞘氨醇桿菌具有降解纖維素功能，其相對豐度增加，有助于糞便物料中纖維素的降解；假黃色單胞菌屬菌株常用于生物防治，對污染物降解也具有很好的作用，其相對豐度提高，可提升發酵物料的功能；嗜熱菌屬高溫期相對豐度增加，有利于物料高溫發酵［20，21］。本研究發酵牛糞高溫菌劑為芽孢桿菌，其相對豐度大幅度提高，與高溫期大量繁殖有關。Pedobacter（土地桿菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）和Psychrobacter（嗜冷桿菌屬）大多數為有害菌，高溫發酵后相對豐度極低甚至檢測不到，說明高溫發酵可實現物料無害化。MA期Actinomadura（放線菌屬）和Streptomyces（鏈霉菌屬）豐度提高，兩者是土壤生境中最重要的菌，能產生多種酶 （蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶）、維生素和有機酸等，具有促進有機物質降解和增加土壤養分的功能［22］。

真菌屬數量在高溫期和熟化期明顯增多。其中Aspergillus（曲霉屬）能引起多種物質降解和霉腐，Chaetomium（毛殼屬）具有降解纖維素和生物防治功能，Humicol a（腐質霉屬）能產生熱穩定的纖維素酶、半纖維素酶、木質素酶、淀粉酶，還有存在于牛糞、腐葉中的腐生菌Cephaliophora（頭梗霉屬）、Ascobolus（糞盤菌屬），具有漆酶分泌功能的Coprinopsis（鬼傘屬）等，在牛糞和秸稈高溫腐熟過程中均具有重要作用［13，14］。

綜上所述，各發酵階段細菌種群和數量遠高于真菌。高溫期具有物質降解和轉化功能，真菌種類及數量明顯增加，說明真菌對物料溫度升高和腐熟過程起重要作用。高溫期細菌優勢種群具有嗜熱、降解結構物質、產生抗菌物質的功能特點，有害菌的消失主要發生在高溫期。后續將研究微生物種群代謝組學機理，為高溫堆制生產功能有機肥提供理論和技術支撐。