LncRNA H19調控Runx2表達對非創傷性股骨頭壞死的影響*

宋 強，王振海，李敬武，穆勝凱

(1.沈陽市骨科醫院研究所創傷科 110044；2.聯勤部保障部隊第967醫院骨科，遼寧大連 116011；3.中國醫科大學附屬第一醫院疼痛科，沈陽 110003；4.沈陽市骨科醫院脊柱科 110044)

骨質破壞性疾病多由凝血和纖溶系統紊亂或血液供應不足引起，股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)作為其中之一的致殘疾病，通常出現進行性的股骨頭塌陷和繼發性關節炎，對患者生存質量產生巨大影響，需行全髖關節置換術[1]。ONFH可分為創傷性和非創傷性(non-traumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH)兩種亞型，NONFH常出現在30～50歲的患者，多出現在類固醇皮質激素治療炎性疾病后[2]。有研究指出，NONFH同人類免疫缺陷病毒感染、自身免疫性疾病、酗酒、使用糖皮質激素及凝血障礙有關[3]。也有研究顯示，間充質干細胞(MSCs)成骨分化能力的改變導致骨壞死和骨再生失衡，是NONFH發病的關鍵因素。各因素誘導MSCs向脂肪細胞分化，使細胞增殖和分化能力下降，導致機體自身修復能力降低，ONFH加重。但到目前為止，NONFH發病的具體分子機制仍不清楚[4]。

近年來，隨著人類基因組計劃的完成和高通量測序技術的進步，研究人員已逐漸將研究中心放在非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)的生物學功能上。ncRNAs在調控基因表達中起著至關重要的作用[5]。其中，長度超過200個核苷酸的長鏈非編碼RNAs(long noncoding RNAs，lncRNAs)廣泛參與生物體的生命過程，包括表觀遺傳學、轉錄和轉錄后調控等[6]。LncRNAs作為“腳手架”介導蛋白質間的相互作用[7-8]；作為“引導員”促進蛋白質和基因的啟動子結合；作為“信號”調節鄰近基因的轉錄；作為“誘餌”與微RNA(miRNA)或蛋白質競爭性結合，影響mRNA的轉錄[9]。但目前有關lncRNAs參與NONFH發生、發展的研究并不多見。Runt相關轉錄因子2(RUNX family transcription factor 2，Runx2)的表達是MSCs向成骨細胞譜系分化的充分且必要條件，是成骨細胞分化的標志[10]。Runx2高表達促進成骨細胞分化，而Runx2表達水平下調可能促進NONFH的進展[11-12]。因此，本研究分析NONFH患者lncRNA H19表達情況，并分析其可能的機制，為NONFH的診斷和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本采集

選取2014年1月至2018年12月在本院治療的42例NONFH患者(NONFH組)，男25例，女17例；年齡30～69歲，平均(49.2±8.3)歲；病程1～11年，平均(5.7±2.5)年。同時選取年齡、性別分布相近的30名健康志愿者作為對照組，排除高血壓、糖尿病、凝血和纖溶系統紊亂、心腦血管疾病及其他慢性疾病。對照組男17例，女13例；年齡28～72歲，平均(48.3±6.6)歲。本研究經本院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。入院當天所有受試者抽取全血20 mL，室溫靜置90 min，1 250×g室溫離心20 min，制備血清標本。

1.1.2主要儀器與試劑

用于H19基因敲降的小干擾RNA(si-RNA)慢病毒、對照病毒及Runx2過表達質粒均購自上海吉凱基因化學技術公司。實時熒光定量PCR(RT-PCR)儀購自瑞士Roche公司，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；鼠抗人Runx2抗體(1∶200)、兔抗人GAPDH抗體(1∶1 000)及二抗(1∶2 000)均購自美國Boster公司。人骨髓間充質干細胞(hMSC-BM)購自美國ScienCell研究實驗室。

1.2 方法

1.2.1細胞培養

hMSC-BM培養于含10%胎牛血清和1%抗生素-抗真菌溶液(美國Invitrogen公司)的高糖DMEM培養基，37 ℃、50 mL/L CO2培養，當細胞生長至80%～90%時，收集、傳代。對于成骨細胞分化實驗，將培養基替換為含10%胎牛血清和100 ng/mL重組人骨形態發生蛋白-2(BMP-2，美國R&D Systems公司)的培養基，培養6 d。

1.2.2RT-PCR

TRIzol法提取總RNA，并檢測純度及濃度。依據日本TaKaRa公司試劑盒說明書進行逆轉錄和PCR反應。H19的上游引物序列為5′-GGT TGG AGT TGT GGA GAC-3′，下游引物序列為5′-GCG TAA TGG AAT GCT TGA A-3′；Runx2上游引物序列為5′-CGG CCC TCC CTG AAC TCT-3′，下游引物序列為5′-TGC CTG CCT GGG GTC TGT A-3′；U6的上游引物序列為5′-TTA TGG GTC CTA GCC TGA C-3′，下游引物序列為5′-CAC TAT TGC GGG CTG C-3′。采用2-ΔΔCt法計算二者的相對表達水平。ΔCt=Ct標記物-CtU6。以U6作為內參進行相對定量，重復3次。

1.2.3細胞轉染

Lipofectamine 2000將過表達和沉默載體轉染進入細胞，轉染48 h后，觀察細胞生長情況，收集細胞用于進一步研究。Si-H19#1(5′-3′)：CCU CUA GCU UGG AAA UGA AUA(引導鏈)，UUC AUU UCC AAG CUA GAG GGU(過客鏈)；Si-H19#2(5′-3′)：GCA CUA CCU GAC UCA GGA AUC(引導鏈)，UUC CUG AGU CAG GUA GUG CAG(過客鏈)。

1.2.4Western blot

提取細胞總蛋白，制備8%聚丙烯酰胺凝膠，每孔20 μg上樣；80 V積層膠，120 V分離膠進行電泳，100 V轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜90 min，5%牛血清蛋白(BSA)封閉PVDF膜1 h，加一抗，4 ℃振蕩過夜。TBST洗滌后滴加二抗，37 ℃孵育1 h，顯影成像。GAPDH作為內參，ImageJ軟件獲取灰度值。

1.2.5CCK-8增殖實驗

細胞轉染后24、48、72 h加入CCK-8試劑，37 ℃、5% CO2條件下培養2 h，多功能酶標儀測定450 nm處吸光度值(A450值)。每組設2個復孔，實驗重復3次。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 NONFH患者及健康受試者血清lncRNA H19、Runx2表達情況

RT-PCR結果顯示，lncRNA H19在NONFH患者血清中的表達水平為0.43±0.07，較lncRNA H19在健康受試者血清中表達水平(1.03±0.18)降低，差異有統計學意義(P<0.05，圖1A)。而Runx2在NONFH患者血清中的表達水平為0.54±0.10，低于健康受試者血清中Runx2表達水平(1.05±0.13)，差異有統計學意義(P<0.05，圖1B)。

A：血清lncRNA H19相對表達水平比較；B：血清Runx2相對表達水平比較；a:P<0.05,與對照組比較。

2.2 BMP-2促進lncRNA H19在hMSC-BM中表達

應用不同濃度的BMP-2誘導hMSC-BM的成骨分化，分別采用0、25、50、100、200 ng/mL BMP-2處理hMSC-BM，RT-PCR檢測lncRNA H19表達水平變化，隨著BMP-2加入量的增加，lncRNA H19的表達水平明顯上升(P<0.05)，但在BMP-2加入至100 ng/mL后，lncRNA H19表達不再明顯增加(P>0.05)，見圖2。

a：P<0.05。

2.3 lncRNA H19表達對Runx2的影響

在hMSC-BM中分別過表達和沉默lncRNA H19，確定基因操作工具有效，其中si-H19#1具有更優的沉默效率(P<0.05，圖3A)；采用RT-PCR和Western blot檢測過表達或沉默lncRNA H19后Runx2表達水平的變化，結果顯示lncRNA H19的表達變化并不引起Runx2 mRNA表達變化(P>0.05，圖3B)，而對Runx2水平變化影響明顯(P<0.05，圖3C)。

A：轉染si-H19和過表達質粒前后lncRNA H19表達情況；B：轉染si-H19和過表達質粒前后Runx2 mRNA表達情況；C：轉染si-H19#1和過表達質粒前后Runx2表達情況；NC：對照病毒質粒；a：P<0.05，與NC比較。

2.4 lncRNA H19和Runx2對hMSC-BM增殖能力的影響

CCK-8驗證lncRNA H19和Runx2對hMSC-BM增殖能力的影響。將si-H19#1序列轉染進入hMSC-BM后，細胞的增殖能力明顯下降。在此基礎上過表達Runx2，被抑制的細胞的增殖能力部分恢復(P<0.05)，見圖4。

NC:對照病毒質粒；a:P<0.05，與si-H19#1比較。

3 討 論

NONFH病因復雜，可由多種原因引起，對股骨頭的損傷尤為突出，目前其病因和致病機制尚不清楚。日本第4次全國NONFH流行病學調查數據顯示，致病因素中激素占50%，酒精占27%，酒精+激素性占2%，其他因素占21%[13]。目前針對NONFH早期患者以口服降脂藥、抗凝藥和雙磷酸鹽藥物等為主，易引起胃腸道不適反應，并可能對肝、腎功能造成損傷，療效欠佳[14]。對于中晚期患者多采取手術治療，壞死晚期采用人工關節置換術，但手術存在費用高、創傷大、并發癥多等缺點。因此，進一步探究NONFH的發生、發展機制，從分子水平探究其發病原因，給予針對性的靶向治療，可能是臨床治療的突破口。

在過去的20年里，高通量測序技術的發展極大地加速了基因表達調控的相關研究。大量研究認為，ncRNA的表達改變是疾病發生的驅動因素之一[15-16]，廣泛參與生物體的生命過程，如染色體重構、細胞分化及免疫應答等[17]。NONFH的發生需要ncRNA的參與。LI等[18]在1項糖皮質激素誘導的NONFH研究中發現了11個可能參與NONFH發生、發展的miRNAs，而WEI等[19]和CHEN等[20]分別發現了lncRNA HOTAIR和lncRNA AWPPH可能參與NONFH相關成骨基因的轉錄調控。本研究發現，lncRNA H19在NONFH患者血清中表達水平明顯降低，可能參與NONFH的病理生理過程。lncRNA H19定位于人11p15.5，是第一個被證實為具有印記特性的基因[21]，在胚胎期表達，出生后表達下降，而往往在腫瘤及其他疾病中再次出現[22]。lncRNA H19過表達同血管生成和細胞增殖密切相關[21，23]。同時，過表達的lncRNA H19可以誘導卵巢癌細胞的上皮間質轉化(EMT)，促進其侵襲轉移[23]。有研究認為，lncRNA H19介導MSCs的多種分化過程，參與肌肉骨骼系統的再生，并對骨代謝過程進行調控[24]。

骨的形成主要是由骨祖細胞、軟骨祖細胞及細胞外基質協同作用完成，而細胞增殖分化、細胞外基質成熟、礦化和細胞凋亡是成骨細胞在骨形成中的4個主要階段。成骨細胞分化改變是NONFH發生、發展過程中的關鍵病理變化[11]，而BMP-2能夠誘導成骨細胞分化[25]。本研究發現，lncRNA H19在hMSC-BM中的表達水平同BMP-2加入劑量相關，BMP-2以濃度依賴的方式促進lncRNA H19在hMSC-BM中的表達，提示lncRNA H19參與了成骨細胞分化的調控。本研究結果顯示，lncRNA H19和Runx2在NONFH患者血清中均表達降低；而在hMSC-BM中過表達lncRNA H19后能夠在轉錄后水平促進Runx2的表達；相反，在抑制了lncRNA H19的表達后Runx2的表達也隨之降低。而在細胞增殖的回補實驗中發現，抑制lncRNA H19后細胞的增殖能力減弱，而過表達Runx2后，細胞的增殖能力部分恢復，提示lncRNA H19對細胞增殖能力的影響是通過Runx2實現的。

綜上所述，與健康對照相比，NONFH患者lncRNA H19表達下調。lncRNA H19能夠促進hMSC-BM中Runx2表達，并誘導細胞增殖。因此，lncRNA H19可能通過影響Runx2表達參與NONFH的發生、發展，但二者之間調控的具體機制仍需進一步探討。此外，血管內凝血學說認為各種系統疾病激活的血管內凝血也可能是引起骨內血栓和骨壞死的重要途徑，NONFH患者往往存在血小板活性程度增高、凝血趨勢增加的高凝和低纖容狀態。lncRNA H19和Runx2在這其中扮演的角色仍不明確，這也是后期基礎向臨床轉化的一個重要討論方向。