CPNE1蛋白在肺腺癌組織中的表達及臨床意義

許正卿 周敏 宋鵬濤 王金志 劉順林*

肺癌是導致癌癥死亡的主要惡性疾病。非小細胞肺癌是肺癌的主要病理類型，腺癌占比最高［1-2］。由于肺癌的發病率和病死率較高，早診斷早治療，對患者預后起重要作用。作為Copines家族中第一個被發現的成員，CPNE1在骨肉瘤中具有重要的臨床意義［3］，但目前尚未發現其在肺癌中的作用。本實驗采用免疫組化方法檢測CPNE1蛋白在肺腺癌組織與肺正常組織中的表達情況，并結合臨床資料進行分析，初步探討CPNE1在肺腺癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 肺腺癌石蠟組織標本收集 收集于浙江省湖州市中心醫院、浙江省安吉縣人民醫院2006年至2009年外科切除且經病理確診的人肺腺癌石蠟包埋標本128例，所有患者術前均未進行放、化療。樣本中男67例，女61例，年齡22～80歲，平均年齡61歲。正常肺組織30例，男20例，女10例；年齡46～74歲，平均年齡60歲。所有組織標本均經兩位有經驗的病理科醫生證實。所有標本均按照2009年國際抗癌聯盟（AJCC，2009）TNM分期標準進行臨床分期，Ⅰ、Ⅱ期69例，Ⅲ、Ⅳ期59例；按分化程度低分化65例，高、中分化63例。

1.2 試劑與方法 實驗所用組織蠟塊經連續切片成4 μm厚度后進行免疫組化染色，免疫組化試劑盒及兔抗人CPNE1多克隆抗體購自Santa Cruz公司（美國）。采用免疫組化方法檢測CPNE1蛋白在肺癌組織中的表達，抗體稀釋液代替作為陰性對照。

1.3 免疫組化結果判定 CPNE1蛋白在肺腺癌組織及肺正常組織中免疫組化結果判斷標準參考YU等［4］報道方法。CPNE1蛋白陽性表達為在細胞質及細胞膜上呈現棕黃色或棕褐色顆粒。在高倍鏡下（SP×400）觀察下，以5個不同視野為隨機采取對象，計算陽性細胞總數，按照陽性細胞數所占百分比計算分值：1分為陽性細胞所占百分比<10%，2分為陽性細胞所占百分比>10%且≤50%，3分為陽性細胞所占百分比>50%且≤75%，4分為陽性細胞所占百分比>75%；同時，按照染色強弱不同程度計算分值：1分陰性，2分弱染色，3分中等強度染色，4分強染色。通過上述兩種不同計算分值乘積判斷結果：<4分為（-）；4～8分為（+）；>8～12分為（++）；>12～16分為（+++）。高表達為（++）和（+++）級；低表達為（-）和（+）級。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，用獨立樣本t檢驗；計數資料用卡方檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CPNE1在肺腺癌組織與肺正常組織中表達 CPNE1蛋白表達主要定位在細胞質中，在細胞膜表達較少，見圖1。低表達49例（38.28%），高表達79例（61.72%），30例肺正常組織均為低表達。

2.2 CPNE1表達高低與患者臨床病理參數的相關性 CPNE1蛋白的表達與肺腺癌組織臨床分期（P<0.05）、TNM分期（P<0.05）、遠處轉移（P<0.05）存在相關性，見表1。

圖1 CPNE1在肺腺癌組織與肺正常組織中表達

表1 CPNE1表達與臨床病理資料的相關性［n（%）］

3 討論

據最新的全球腫瘤發病統計資料顯示，肺癌的發病率和死亡率居各種惡性腫瘤的首位，而且對其能做出早期診斷和預后判斷的有效分子標志物極少。根據目前的研究，多種癌基因和抑癌基因突變在肺癌的發生發展中起相當作用，如癌基因K-RAS、EGFR、PD-L1，抑癌基因突變TP53、RB等［5-6］。近年來，研究認為肺癌是一種具有異質性的疾病，不同癌基因、抑癌基因參與不同患者的發病，即便是同一個患者肺癌的發病過程中，也可能存在不同的癌基因或抑癌基因參與［7-9］。目前所知的癌基因、抑癌基因突變并不能解釋所有的肺癌發生發展，這也提示存在不為所知的基因參與到肺癌的發病中。

CPNE蛋白家族（Copines）是一類磷脂結合蛋白，家族成員均有共同的結構特征：C末端有1個A結構域，與整和蛋白胞外區段的A結構域間具有較高的同源性；N末端有2個C2結構域，與具有Ca2+依賴和磷脂結合特性的C2結構域具有高度相似性。整和蛋白的A結構域能與Ca2+和Mg2+結合，也是整和蛋白與胞外配體發生蛋白相互作用的結構域。CPNE蛋白與其目標蛋白相互作用可能與目標蛋白募集或調節目標蛋白的酶活性有關［10-11］。

CPNE1作為一種可溶性膜結合蛋白，可以通過C末端A結構域與不同細胞內蛋白質結合。進一步研究表明，該A結構域已在多種整合素和細胞外基質蛋白中進行研究，并可作為蛋白結合域［12］。C2結構域對鈣和磷脂結合非常重要［13-14］。此外，多種蛋白質已被鑒定為Copine靶標，其中較多是參與細胞內信號通路的蛋白質，包括MEK1/ERK、蛋白磷酸酶5和CDC42調節蛋白激酶［15］。最近一項研究表明，在前列腺癌中CPNE 1表達高于正常前列腺組織，CPNE1過表達與前列腺癌患者分期及預后相關，且CPNE 1可以作為前列腺癌診斷的一個指標，進一步通過TCGA數據共表達分析發現CPNE1與TRAF2顯著相關［16-17］。而在骨肉瘤中的研究顯示，干擾CPNE 1可以抑制骨肉瘤Saos-2細胞的增殖和克隆，并對細胞凋亡有促進作用。干擾骨肉瘤中CPNE 1的表達使Saos-2細胞可以改變基因表達譜。改變的基因參與多種信號傳導途徑，包括MAPK途徑，TGF-β通道等。此外，高群等［18］研究CPNE 1與細胞凋亡的關系，在體外缺氧/復氧誘導的H9c2細胞中，干擾CPNE 1基因后發現，干擾CPNE 1基因表達后同時下調C-caspase3蛋白表達，降低細胞凋亡率。通過敲減心肌細胞CPNE 1基因的表達，可以使凋亡相關Bcl-2蛋白表達上調、同時Bax蛋白表達出現下調，該研究結果表明CPNE 1能夠抑制心肌H9c2細胞凋亡［18-19］。此外 C-caspase 3是Caspase 3的剪切體，也是細胞凋亡發生的分子標志物，參與多種細胞凋亡過程［20］。干擾CPNE 1基因表達后可能通過NF-κB活性增強抑制心肌細胞的凋亡發生，從而發揮心肌保護作用［21-22］。

CPNE 1在非小細胞肺癌中的作用尚不清楚。本資料結果顯示，CPNE 1在腺癌中的表達高于正常肺組織，差異均有統計學意義（P<0.05），表明CPNE1在肺腺癌中可能起到促癌基因的作用。進一步分析CPNE 1蛋白表達與肺癌患者臨床病理各參數的相關關系，分層分析發現CPNE 1基因表達水平與非小細胞肺癌患者性別、年齡、腫瘤大小無明顯相關性（P>0.05），但在淋巴結轉移患者組織中表達高于非淋巴結轉移患者，差異有統計學意義（P<0.05），提示CPNE 1基因表達水平可能與非小細胞肺癌患者預后有關。非小細胞肺癌中CPNE 1基因具有促癌作用，但其如何介導肺癌的發生發展目前尚未得知，需進一步研究。