基于TMT 技術的袖皮素磷脂復合物抑制大鼠脈絡膜新生血管形成的蛋白質組學研究

吉潔 ，徐新榮，王富強，周春剛，唐苗苗，唐穎，王榮榮，程立

在多種眼底疾病如病理性近視、年齡相關性黃斑變性、眼組織胞漿菌病等中常發(fā)生脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)，嚴重影響患者視功能，造成脈絡膜滲出、出血，嚴重者可導致視力下降[1]。目前治療藥物主要為血管內皮生長因子拮抗劑以及類固醇類抗炎藥，臨床療效雖好，但由于藥物會升高眼壓，需多次注射，給患者治療帶來巨大的經濟壓力。因此，尋找安全有效藥物是目前治療CNV 的重要任務[2]。袖皮素(naringenin，Nar)屬于二氫黃酮化合物，其能夠抑制CNV，但袖皮素單體在水中溶解度不高，生物活性低。近期研究[3]顯示袖皮素與磷脂結合后改善單體理化性質,有效提高天然活性成分的體內吸收，提高其生物利用度。本研究通過制備脈絡膜新生血管大鼠模型，給予袖皮素磷脂復合物(naringenin phospholipid complex，NPC)治療，應用串聯質譜標簽(tandem mass tags，TMT)技術比較模型組和NPC 治療組CNV 組織中蛋白質表達差異，同時對蛋白表達譜進行生物學分析，以探究其對CNV的抑制作用以及可能的機制，為該病治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Brown Norway(BN)大鼠，雄性，SPF 級，體重200～220 g，由北京維通利華動物技術有限公司提供[SCXK(京)2015-0012]，所有大鼠均在恒定25℃，濕度為50%的環(huán)境中，每天光照12 h(8：00～20：00)，自由飲水攝食。

1.2 儀器與試劑

Thermo Scientific Co.Q Exactive Orbitrap (LCMS/MS)；戴安納升高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技公司，LC)；島津高效液相色譜儀 (日本，LC20A)；布魯克Ultraflex; Tanon 電泳槽(中國上海力敏實業(yè)有限公司，VE-186)；UMAX Powerlook 2100XL-USB 掃描儀(中國世群國際)；IKA 振蕩器；恒溫加熱塊(鼎國昌盛生物技術有限公司)；DYY-7C型電泳儀(北京六一儀器廠)；LX-100 手掌式離心機(其林貝爾儀器)；離心(eppendorf centrifuge 5417R型)；電熱恒溫水浴鍋(長安科學儀器);尿素(Gibco-BRL 公司)；CHAPS(Calbiochem 公司)；碘乙酰胺(IAM)(Promega 公司)；丙烯酰胺(SIGMA 公司)；二硫素糖醇(DTT)(Promega 公司)；SDS(SIGMA 公司)；過硫酸胺(AMRECSO)；甲叉雙丙烯酰胺(SIGMA 公司)；N,N,N’,N-四甲基乙烯二胺 (TEMED)(SIGMA公司)；溴酚藍(SIGMA 公司)；SCX 強陽離子交換柱(phenomenex Luna SCX 100A)；strata-X C18 除鹽柱(phenomenex)。

1.3 動物模型及藥物制備

1.3.1 大鼠CNV 模型制備 健康雄性BN 大鼠在造模前禁食12 h，10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉動物，用新福林與0.5%托吡卡胺混合散瞳劑充分散瞳，采用氪黃激光(參數：光斑直徑100 μm，曝光時間0.1 s,功率150～200 mW)，用專用前置鏡(120 D)，分別在左右眼的視網膜大血管間光凝8 個點，激光斑均圍繞視盤并距視盤2～4 個視盤直徑，光凝擊破Bruch’s 膜后產生小氣泡為合格光凝點。將視網膜、脈絡膜或玻璃體有出血的大鼠剔除，造模成功后待大鼠麻醉蘇醒送回SPF 飼養(yǎng)箱。

1.3.2 NPC 制備 將質量濃度為5 g/L 的袖皮素溶解于適量無水乙醇中，按照袖皮素和大豆磷脂1:2的質量比加入大豆磷脂，加溫至60℃，恒溫攪拌2 h，使之均勻成溶液狀態(tài)。將溶液過濾，濾液經洗滌真空干燥24 h 后得到NPC。用100 目篩研磨后置于干燥器中備用。

1.4 實驗分組及給藥

模型大鼠隨機分為正常對照組5 只，模型組5 只，NPC治療組5 只。正常對照組和模型組不給藥，NPC 治療組給藥劑量：30 mg/kg/d，為腹腔注射。視網膜光凝后當天開始給藥至觀察4 周結束。

1.5 蛋白組學方法

1.5.1 蛋白質提取 大鼠視網膜光凝給藥治療4 周后頸椎脫臼處死摘取眼球。眼球摘取后即刻用冰鹽水(含0.1%PMSF)沖洗,在手術顯微鏡冰浴下沿角膜緣男去角膜，小心去除晶狀體和玻璃體。放射狀男開眼杯，用虹膜復位剝離器刮取RPE-Bruch 膜-脈絡膜復合體，立即凍存于液氮中。取出保存于液氮中的標本，室溫下從每組標本中提取1 mgCNV 組織蛋白質,按1：7 的比例加入裂解液(7 M 尿素，2 M 硫尿)，勻漿，靜置1 h，每隔15 min 震蕩1 次，4°C 40,000 G 離心1 h，取上清，BCA 定量。每組取100 μg 蛋白，加入DTT 到濃度為10 mM。在56°C 水溫中水浴1 h。取出然后快速加入IAM 到濃度為55 mM，在暗室中靜置1 h。加入預冷丙酮，體積4 倍于樣品溶液，-20°C 沉淀超過3 h。20,000 g 于4°C 離心20 min，取出沉淀，加入復溶buffer 300 μl，最終濃度為50%TEAB，0.1%SDS。超聲助溶3 min。對肽段使用bradford 法進行定量。

1.5.2 蛋白質的消化 每份樣品100 μg 蛋白體積，以TEAB (含0.1%SDS) 補齊各份樣品體積。加入Trypsin 1 μg/μl，3.3 μg 的酶加入到每100 μg 蛋白質底物中，以37°C 水浴24 h，Trypsin 1 μg 補加入。37°C下放置12 h。將消化液凍干后，每管用30 μl TEAB(水：TEAB=1:1，含0.1%SDS)復溶肽段。取1 μl，使用MALDI Tof/Tof 檢測消化后肽段的消化效率。

1.5.3 肽段的標記 平衡標記試劑至室溫，70 μl 異丙醇加入到每管標記試劑中，vortex 1 min，離心甩至管底。將處理完畢的標記試劑加入至肽段中，用不同大小的同位素標記不同樣品。樣品各分別標記為126、127、128、129、130、131。混勻后，甩至管底，室溫靜置2 h。

1.5.4 HPLC(強陽離子交換色譜) 標記后用A 液稀釋樣品10 倍，磷酸的pH 值調至3.0，取上清液前15,000g離心10 min。A 液成分：25%ACN，10 mMK H2PO4。B 液(pH 值3.0)成分：25%ACN，2MKCL，10 mMKH2PO4。配好A B 液后，進行管外超聲5～10 min 后，使用有機膜(0.22 μm 或0.45 μm)過濾。先后打開機器，閥門，接著AB 泵用MilliQ 水排氣，排氣后關上閥門。用MilliQ 水對柱子進行10 min 左右的沖洗，同時觀察壓力平衡情況。之后，A 液放入A 泵中，B 液放入B泵中，閥門打開，讓A 泵、B 泵各充滿液體。關閉閥門后用A 液平衡系統(tǒng)調B 泵至0%達10～20 min(1ml/min)，同時平衡，直到壓力和吸收峰都走平后上樣。使用進樣針在定量環(huán)中注入樣品。扳上注射口開關，注入后再扳下開關、拔針。樣品收集后進行平衡清洗。A 液平衡10 min 后，流速調至0，MilliQ 水中放入A 泵和B泵，閥門打開后沖泵。沖洗到吸收峰、壓力走平后，沖甲醇，關閉閥門。

1.5.5 肽段的純化(C18 反相色譜除鹽) 甲醇1ml 活化柱料，流速2-3 滴/s，5%ACN1 滴/s 進行平衡，用MilliQ水1ml 對樣品溶解過柱。用5%乙腈1ml 以1 滴/s 洗柱除鹽，以流速1 滴/s 將純乙腈2500 μl 洗脫。低溫離心后將乙腈抽干，然后以0.1%甲酸復溶肽段。

1.5.6 質譜檢測、蛋白質定性與定量分析使用高精度液質聯用型質譜(Thermo-fisherQ-Exactive-Orbitrap)檢測肽段信號，然后得出蛋白定性定量結果。掃描質譜完成后得到質譜信號總圖，再將之轉換為mgf 文件。應用Mascot 軟件(MASCOT 2.3.01)進行定性檢索與定量分析。肽段相對定量根據離子的相對豐度，蛋白的相對定量結果根據肽段相對定量結果統(tǒng)計得出。差異蛋白質的篩選標準：同一蛋白在某一組相對于另一組的比值大于1.3 倍(上調)或小于-1.3 倍(下調)，且P＜0.05。通過檢索數據庫Gene Ontology Database，對最終鑒定出的蛋白質進行GO功能注釋。

2 結果

2.1 鑒定蛋白質及差異表達蛋白

同位素峰面積應用Mascot 軟件中Scaffold 算法進行計算，CNV 組織中的蛋白質鑒定和相對定量通過檢索Swissprot_human 數據庫完成。最終鑒定特有肽段序列10819 個，鑒定得出蛋白質2717 個。比較了模型組與NPC 組的差異表達蛋白質。相對于模型組，在NPC 組中蛋白質上調或下調表達趨勢一致的差異蛋白共有113 個，其中上調蛋白質57 個，下調蛋白質56 個(表1)。模型組與正常對照組上調或下調表達趨勢一致的差異蛋白共有314 個，其中上調蛋白質202 個，下調蛋白質112 個(表2)。袖皮素磷脂復合物組與正常對照組上調或下調表達趨勢一致的差異蛋白共有90 個，其中上調蛋白質22 個，下調蛋白質68 個(表3)。

表1 模型組與NPC 組之間的差異表達蛋白質

2.2 生物信息學分析

GO(gene ontology)注釋：通過檢索數據庫Gene Ontology Database (參見其網站http://www.geneontology.org/)，初步分析篩查所得的蛋白質所參與的生物過程、分子功能、細胞組分。蛋白質的功能注釋采用了BLAST2GO(參見其主頁http://www.blast2go.com/b2ghome) 來進行。結果顯示:這些蛋白主要在24 種生物學過程中發(fā)揮作用，包括細胞殺傷、免疫系統(tǒng)過程、細胞粘附、代謝過程、細胞增殖、細胞轉化、生殖過程、信號傳遞、多細胞生物過程、刺激應答、生物調節(jié)、多生物進程、定位、細胞解毒作用等(表4)；4 種細胞組分被包含其中，包括細胞內的、細胞、蛋白復合體、細胞結構實體等(表5)；與13 類分子功能緊密相關，包括結合、催化活性、結構分子活性、轉運活性、分子功能調節(jié)、轉錄調節(jié)活性、抗氧化活性、翻譯調節(jié)活性、信號受體活性、鈣離子傳感器活性等(表6)。

表2 模型組與對照組之間的差異表達蛋白質

表3 NPC 組與對照組之間的差異表達

表4 差異蛋白生物學過程分類分析

表5 差異蛋白生物學過程分類分析

表6 差異蛋白生物學過程分類分析

3 討論

脈絡膜新生血管發(fā)生涉及多因素，包括高齡、吸煙、高血壓、心血管疾病等，而其具體發(fā)病機制目前尚未明確，多數研究認為VEGF 異常、Bruch’s 膜受損與其發(fā)生密切相關[4]。近年來,中藥逐漸成為抑制眼部新生血管治療的熱點，其安全性高，價格便宜，尤其是黃酮類藥物，如袖皮素、人參皂苷、鈍頂螺旋藻多糖提取物等有強抑制眼部新生血管作用。袖皮素存在于胡袖皮、檸檬、枳殼、橘子等，具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗癌等功效。動物研究[5]顯示，其能夠抑制脈絡膜血流，并通過抑制體內氧化應激反應，緩解CNV 形成。但其水溶性差，生物利用率低。研究[6-7]報道天然黃酮類物質與磷脂具有特殊的親和力，可在一定條件下形成復合物，并能增強母體的生物、藥理活性。課題組前期研究結果也顯示NPC 治療組CNV 面積和熒光滲透顯著低于袖皮素治療組，NPC 治療組對NF-κB、iNOS、VEGF、COX-2、MMP-2、MMP-9 表達的抑制作用優(yōu)于袖皮素組，表明NPC 的生物活性較袖皮素顯著提高，抑制脈絡膜新生血管的效果優(yōu)于Naringenin[8]。

蛋白質組學技術的應用為研究疾病發(fā)病機制、尋找適宜的生物標志物提供了可能[9]。1994 年，Wilkins 與Williams 首次提出蛋白質組(Proteome)的概念，它意指“一種基因組所表達的全套蛋白質”，源于蛋白質(protein)與基因組(genome)兩個詞的組合。即指在某個時間和空間內，一種生物、一種組織或一種細胞所表達的所有亞型以及所有經過修飾的全部蛋白質[10]。Wei Q 等[11]對伴有脈絡膜新生血管的病理性近視視網膜劈裂患者的玻璃體液進行蛋白質組學研究，發(fā)現細胞粘合、蛋白酶抑制劑、促血管生長因子、抗血管生長因子等28 種蛋白，康柏西普眼內注射組相比對照組明顯下調，α-平滑肌肌動蛋白明顯上調。

生物質譜技術快速發(fā)展，具有高靈敏度、高通量和大動態(tài)范圍等優(yōu)勢，在蛋白質組學研究中二維凝膠電泳技術逐步被取代，質譜技術成為現在的主流技術。TMT 技術是一種對多肽末端和側鏈的氨基基團進行特異性標記的體外標記技術。具有相當高的通量，在串聯質譜分析的基礎上，2 組、6 組甚或10組不同樣品中蛋白質的相對含量可同時比較。并且可以廣泛應用于對細胞、組織等的樣品標記，標記率高，反應速度快，被廣泛用于特殊功能蛋白質篩選、疾病發(fā)病機制研究、疾病標志物篩選、藥物作用靶點研究等。2018 年Ming Wang 等[12]利用TMT 標記食管鱗狀腫瘤細胞 (ESCC)，用定量蛋白酶激活受體4(PAR4)在食管鱗狀腫瘤細胞中的抑癌作用。本次試驗采用6 標TMT 試劑，其中包括6 種等量的同位素試劑，能夠標記蛋白質酶解后的肽段，從而通過串聯質譜方法，對肽段進行精確鑒定和定量。

在本研究中，對模型組、NPC 組大鼠CNV 組織和正常對照組大鼠脈絡膜組織進行蛋白質鑒定，最終鑒定到特有肽段序列10819 個，蛋白質2717 個。比較模型組和NPC 組、模型組和正常對照組、NPC組和正常對照組，差異表達蛋白分別為113 個(上調蛋白質57 個，下調蛋白質56 個)、314 個(上調蛋白質202 個，下調蛋白質112 個)、90 個(上調蛋白質22 個，下調蛋白質68 個)。通過檢索數據庫Gene Ontology Database 進行搜索，對篩查到的差異蛋白質所參與的生物過程、分子功能、細胞組分進行了初步分析。生物信息學分析表明，差異蛋白主要參與24 種生物學過程、4 種細胞組分和13 類分子功能。主要功能集中在結合作用、抗氧化活性、催化活性、轉運活性、轉錄調節(jié)等。本次研究為闡明NPC 對脈絡膜新生血管的作用機制打下了基礎。今后還將進一步進行差異蛋白KEGG 通路分析、相互作用節(jié)點中心蛋白的驗證，以進一步研究具體作用機制。