質譜檢測聯合下一代測序在新生兒遺傳代謝病診斷中的應用

于愛真，馮雪，王欣

深圳市兒童醫院新生兒科，廣東 深圳 518000

遺傳代謝病(inherited metabolic diseases，IMD)是一種病種繁多的先天性代謝缺陷，包括氨基酸、有機酸、脂肪酸、激素、糖、溶酶體貯積等缺陷，且對于嬰幼兒來說，雖然體內生化激素水平實質已有顯著變化，但臨床表現常為非特異性，因此僅依靠臨床表現早期診斷困難，且一經發病，往往病情危重[1-2]。根據相關文獻報道，對部分患兒在疾病明顯出現臨床表現之前，通過先天性遺傳代謝病篩查，可以有效改善預后。隨著醫學檢測技術的不斷完善及提高，串聯質譜技術引入遺傳代謝病篩查之中，能夠同時對多種代謝物進行快速檢測，實現一種實驗檢測多種疾病，極大的提高了試驗效率[3-4]。但由于串聯質譜技術檢測極易受患兒病情、治療等因素影響，造成誤診、漏診，下一代測序技術通過對患兒的數百萬條基因進行大規模平行測序，生物信息學分析，整合基因表達及調控，提供準確的分子診斷，有效彌補了串聯質譜技術的不足[5-6]。本研究旨在探究質譜檢測聯合下一代測序在新生兒遺傳代謝病診斷中的應用效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2016年6月至2020年6月深圳市兒童醫院收治的289例臨床表現疑似遺傳代謝病新生兒為研究對象。納入標準：①臨床資料完整；②本研究經醫院倫理學委員會討論通過，家屬對本研究知情同意，且簽署相關文書。排除標準：①特殊面容者；②神經、心血管、消化、泌尿生殖等系統畸形或嚴重障礙者。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 液相串聯質譜檢測采用美國Waters公司Acquity TM TQD串聯質譜儀，多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測定試劑盒(Neo BaseNon-derivatized MSMS Kit)由美國Perkin Elmer公司提供；變異按照人類基因組變異協會規則命名。

1.2.2 采集標本 干血片標本采集須嚴格遵守新生兒疾病篩查技術規范，采血時間約為72 h后，且所有受試者均得到6次以上的充分哺乳，增加代謝疾病診斷準確率。取受試者空腹靜脈血，滴至濾紙片，等待自然滲透，保證采集濾紙片上具有均勻血斑4枚，≥8 mm，濾紙架懸空自然干燥約3 h，血斑呈現出深褐色，塑料袋密封，置于4℃溫度保存待檢。如果采集的干血片樣本過小，出現污染、無法滲透或者不干燥等情況，應退回重新采集血樣。

1.2.3 串聯質譜儀初篩 對濾紙干血片中含有的氨基酸和酰基肉堿經甲醇溶劑萃取后，由液相泵混合流動相輸送進入質譜離子源，應用電離學原理行質譜分析，具體操作如下：①首先將濾紙干血片樣本與質控品打孔，直徑為3 mm，呈圓形濾紙片，置于96微孔板中；②對氨基酸和酰基肉堿進行稀釋，加入萃取液，琥珀酰丙酮加入分析，配制工作液，混勻2 min；③而后96微孔板中工作液分別為100 μL/孔，封膜標記，預熱振蕩儀，以700 r/min的轉速震蕩約45 min，注意對相關儀器進行預維護與清洗，自動進樣器每次進樣2 μL，樣品平均測試時間約為7 min/個。檢測結果由本院質譜室專業技術人員根據患兒血尿代謝譜變化，結合患兒臨床資料分析判斷。

1.2.4 復查所有病例 按照各遺傳代謝病生化代謝途徑的特異性指標，陰性確診者及時提供隨訪治療，陽性進行原血片復查；對于明顯高于截斷值判斷出的可疑陽性病例，立即召回復查，對于進行復查后的各陰性及時治療，陽性進行下一代測序基因診斷。

1.2.5 基于下一代測序技術的基因診斷 下一代測序通過Ion Torrent PGM技術，通過目的DNA提取、基因擴增、文庫構建、乳液PCR和測序流程分析，由本院委托外部專業分子診斷中心臨床人員進行最終分子遺傳學診斷。具體操作方法：①取上述質譜檢測可疑陽性患兒靜脈血5 mL，抗凝處理，對其中血樣2 mL采用Qiagen Blood DNAminikit提取基因組DNA，Qubit測定濃度后-20℃保存待測，3 mL血樣留存；②采用遺傳代謝病基因檢測捕獲Panel，多重探針雜交方法靶向富集目標區域序列，按照Vazyme建庫說明處理處理純化產物，經Qubit以及2100 Bioanalyzer質檢分析確定濃度與大小及格，Hi Seq 2500平臺進行測序；③最后進行數據處理，利用BWA序列對比法，質控序列對比人類基因組參考序列，注釋軟件Annovar注釋突變位點到公共突變數據庫，結合患兒情況，進行致病性解讀。

1.3 統計學方法 選擇SPSS24.0軟件進行數據統計學分析，以下一代測序結果為金標準，根據四格表計算質譜檢測結果診斷新生兒遺傳代謝病的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及其95%CI。

2 結果

2.1 一般情況 289例臨床表現疑似遺傳代謝病新生兒，男性156例，女性133例，最終確診病例為40例，男性22例，女性18例，出生體質量1 402～1 780 g，平均(2.27±1.38)g；年齡≥2 h，隨訪至6個月齡結局。其中脂肪酸代謝病15例、氨基酸代謝病14例、有機酸代謝病11例，見表1。

表1 40例遺傳代謝病新生兒一般情況

2.2 串聯質譜聯合下一代測序檢測 疑似遺傳代謝疾病的289例高危新生兒質譜檢測初篩時，檢測提示遺傳代謝疾病結果為34例，有機酸代謝病14例、氨基酸代謝病12例、脂肪酸代謝病8例。以下一代測序檢測為金標準，遺傳代謝疾病結果為40例，以質譜檢測待測標準提示遺傳代謝疾病結果為34例，證明質譜檢測的敏感度為78.8%(95%CI：61.1%～91.0%)，特異度為 100%(95%CI：99.8%～100%)，陽性預測值為100%，陰性預測值為99.7%(95%CI：99.3%～99.8%)。質譜檢測與下一代測序檢測提示遺傳代謝病可能結果不一致的有2例，包括質譜檢測中1例檢測到丙氨酸或酪氨酸代謝異常，但下一代測序基因提示存在3-甲基戊烯二酸尿癥；質譜檢測中1例血酪氨酸異常升高，但下一代測序中提示存在基因半合變異，診斷為3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶乏癥。

2.3 確診患兒隨訪 40例確診患兒臨床表現為代謝性酸中毒、血氨水平升高和低血糖等，具有嘔吐、拒奶、呼吸困難、四肢張力異常等特征，所有患兒均建立了隨訪治療檔案，對癥治療，隨訪6個月，其中1例甲基丙二酸血癥患兒出現急性代謝紊亂，對部分患兒在疾病明顯臨床表現出現之前，通過先天性遺傳代謝病篩查，可以有效改善預后；其余患兒基于明確的診斷，干預及時，生長發育良好。

3 討論

新生兒期發病的遺傳代謝病情危重，早期臨床表現缺乏特異性，難以進行及時診斷和提供干預，嚴重威脅新生兒的生命安全[7]。但臨床顯示并非所有遺傳代謝性疾病的患兒均都在新生兒時期發病，因此如果能夠做到早期診斷，在發病之前給予科學正規的治療與隨訪，有效避免高發誘因，可以一定程度上延緩疾病，同時在發病時可以及時提供針對性治療，減少疾病死亡率[8-9]。

根據遺傳性代謝病發病機制發現，患兒體內生化代謝的酶催化反應受損導致體內代謝紊亂，從而繼發各種臨床癥狀，因此其檢測方法需要滿足檢測全面的代謝產物的紊亂狀態，推測其代謝異常的反應阻滯環節，可以得到反應異常酶的靶向定位。隨著近年來對疾病譜研究的深入和分析儀器設備技術的更新，質譜分析在醫學檢驗領域中的應用不斷得到擴展[10-12]。

串聯質譜聯合下一代測序是首先通過質譜檢測快速定量檢測患兒血樣本中多種氨基酸和酰基肉堿，拓展可篩查疾病的種類，應用于臨床，降低了臨床兒科各疑難雜癥的漏診率，使許多遺傳代謝疾病得到了早期的干預和治療，串聯質譜技術檢測的各指標切值是疾病判斷的重要依據，但臨床制定較為困難，需要結合大臨床數據，并進行本地化研究[13-14]。因此，臨床納入下一代測序以期提高早期診斷率。下一代測序這一種大規模平行測序涵蓋了全基因組、外顯子和基因包測序等能夠對血清中金銀片段進行測序，對蛋白質、核酸等生物大分子進行分離檢測，從而對質譜檢查難以確診的疾病診斷具有重要價值[15-16]。

本研究結果顯示，通過質譜檢測聯合下一代測序可以確診為遺傳代謝疾病患兒的有40例，其中脂肪酸代謝病15例、氨基酸代謝病14例、有機酸代謝病11例。本研究先采用質譜檢測進行初篩，解讀質譜分析得到的數據，根據數據判讀、結果分析得到的資料做出本次質譜分析的檢查報告。而后對于所有陰性確診者及時提供隨訪治療，陽性進行原血片復查；對于明顯高于截斷值判斷出的可疑陽性病例，立即召回復查，對于進行復查后的各陰性及時治療，陽性進行下一代測序基因診斷。由于遺傳代謝病涉及人體代謝的廣泛途徑，極其復雜，途徑相互交叉，質譜結果易受患兒飲食、病情、治療和檢測時間等因素的影響，因此體內代謝物水平常無顯著性差異。質譜檢測聯合下一代基因測序可以使臨床對于代謝疾病的診斷模式從傳統的表型診斷上升到基因型診斷的新階段，在基因水平上對疾病作出明確診斷[17-18]。本研究中質譜檢測與下一代測序檢測提示遺傳代謝病可能結果不一致的有2例，質譜檢測1例檢測到丙氨酸或酪氨酸代謝異常，但下一代測序基因存在3-甲基戊烯二酸尿癥；1例質譜檢測血酪氨酸異常升高，但下一代測序中存在基因半合變異，診斷為3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶乏癥，這提示串聯質譜聯合下一代測序檢測可以大大提高了突變檢出率，從而能夠在隨訪治療中及時提供有效干預措施，減少患兒死亡率[19]。

綜上所述，采用質譜檢測聯合下一代測序能夠在涉及多個亞型基因的罕見變異的檢測中作用突出，有助于在新生兒期對于臨床異質性高、表型錯綜復雜的代謝性疾病的高危兒進行積極的檢測及評估，從而提供積極的治療措施。