飼料中色氨酸測定方法研究進展

宋 潔，王麗芳，姚一萍，史 培，張三粉，鐘華晨，郭晨陽

［1. 農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室 （呼和浩特） 內蒙古自治區農牧業科學院， 內蒙古 呼和浩特010031；2. 內蒙古自治區動物營養與飼料科學重點實驗室 內蒙古農業大學動物科學學院， 內蒙古 呼和浩特010018］

圖1 色氨酸結構式

色氨酸（tryptophan，Trp）是一種功能性必需氨基酸，化學名稱為α-氨基-β-吲哚丙酸，結構式見圖1，分子構型有D 型、L 型和DL 型3 種同分異構體，天然存在且易被動物體代謝吸收的為L 型［1-2］。L-色氨酸與賴氨酸、 蛋氨酸并稱為三大氨基酸飼料添加劑，是5-羥色胺、褪黑素、煙酸、輔酶等典型生理活性物質的生化前體， 具有促進動物生長發育、提高免疫力、減緩氧化應激、改善肉品質等作用［3-5］。 色氨酸缺乏將可能導致動物出現采食量下降、體重減輕、神經功能障礙等一系列問題［6］。由于動物自身不能合成色氨酸， 必須從飼料中攝取，飼料中色氨酸含量的準確測定，對于動物體內色氨酸平衡及機體健康至關重要［7-8］。 目前，飼料中色氨酸的測定方法正在不斷發展與完善， 前處理方法主要有常規水解法及微波快速水解法［9-10］，儀器測定主要有光譜法（包括紫外或熒光分光光度計法、近紅外法等）、色譜法（包括氨基酸分析儀法、高效液相色譜法、氣質聯用、毛細管電泳等方法）［11-12］。 多種分析方法的結合使色氨酸分析的靈敏度、精確度以及自動化程度有了很大提高。該文對目前常用飼料中色氨酸主要分析方法進行綜述， 對于飼料營養品質評定工作具有十分重要的參考價值。

1 前處理方法

水解是色氨酸含量分析的關鍵步驟， 水解質量的好壞直接影響分析結果的準確性［13］。 色氨酸在酸性條件下易分解， 無法通過酸水解與其他氨基酸同步測出含量，必須單獨測定［14］。 目前，飼料中色氨酸的測定前處理主要通過常規堿水解，耗時過長，容易影響色氨酸分析結果的準確性，通過提高水解溫度， 減少水解時間等條件的優化能有效解決以上問題［15］。 近年來，微波技術因反應快、能耗低、易操作等優勢日益受到關注。微波水解是樣品及水解液極性分子在超高頻電磁波作用下隨微波頻率快速變換取向，分子在來回轉動過程中與周圍分子高速碰撞摩擦，增加總能量，在密閉環境中快速加熱水解，但氨基酸的化學形式不變［16-17］。采用微波堿水解法水解樣品， 不但可以克服常規水解的缺點， 而且易于控制堿水解條件， 具有安全、省時、操作簡便等優點，適用于大規模飼料樣品中色氨酸的高效、準確測定。

2 光譜儀法

2.1 熒光分光光度法

色氨酸屬于芳香族氨基酸， 側鏈具有生色基團，能在280 nm 激發光作用下在不同電子能級之間躍遷產生內源性熒光信號，利用熒光分光光度計可測定色氨酸含量［18］。飼料蛋白中除色氨酸外，通常還含有酪氨酸、 苯丙氨酸等能產生天然熒光的氨基酸，其激發光譜和發射光譜相互重疊，采用常規的熒光分析方法很難準確區分，因此，需要將熒光分光光度法與化學計量學方法相結合實現色氨酸定量分析［19］，利用導數技術可解決光譜重疊問題［20］。

《實驗動物配合飼料氨基酸的測定》（GB/T 14924.10—2008） 采用熒光分光光度法測定實驗動物配合飼料中色氨酸的含量，飼料原料經過堿水解后，在pH 值為11 的條件下，色氨酸的熒光強度比酪氨酸大100 倍，且熒光峰相差40 nm 以上，根據這一特點實現色氨酸的定量分析［21］。 張悅等［22］將同步熒光分析技術與一階導數光譜技術結合，實現了重疊熒光光譜很好的分離效果， 色氨酸的同步特征峰略受酪氨酸弱峰影響， 通過一階導數處理使色氨酸和酪氨酸混合液與色氨酸的一階導數同步熒光光譜在290 nm 波長處重疊，結合峰零法消除酪氨酸干擾，可以準確測定色氨酸含量。王懷友等［20］研究表明，在pH 值為7.4 的條件下，用221 nm 作為激發波長， 采用二階導數熒光光度法能很好地分離色氨酸和酪氨酸，避免光譜重疊。色氨酸在318 nm 處，酪氨酸在283 nm 處，二階導數峰高與濃度呈線性關系，實現同步測定。

2.2 紫外分光光度法

紫外分光光度法能夠對化合物進行定量分析， 測定190～800 nm 波長范圍內樣品吸光度值。色氨酸結構中含有苯環共軛雙鍵結構， 不需添加其他發色試劑， 在紫外區可直接定量， 色氨酸在278 nm 處有最強吸收， 在0.006～0.200 mmol/L 濃度范圍有良好線性［19］。 但由于苯丙氨酸和酪氨酸等其他帶苯環氨基酸干擾色氨酸檢測結果， 需要進行衍生化反應生成具有紫外吸收的化合物，之后采用紫外分光光度計測定色氨酸含量［11］。

《飼料中色氨酸的測定》（GB/T 15400—2018）采用分光光度法測定飼料中色氨酸的含量， 飼料中蛋白質經堿水解后，降解成多肽和游離氨基酸，在硫酸介質中、氧化劑亞硝酸鈉存在條件下，色氨酸C11位的氨基與對二甲氨基苯甲醛發生縮合反應生成藍色化合物， 其吸光度在一定范圍內與色氨酸含量成正比， 在590 nm 波長處有最大吸收，且不受其他氨基酸的干擾［23］。 張婷婷等［24］建立了可見光分光光度法快速、 準確地檢測種子發酵液中L-色氨酸含量的方法。 實驗以對二甲氨基苯甲醛（PDAB）為顯色劑，顯色反應的溫度和時間定為60 ℃水浴20 min，于590 nm 波長檢測。 該方法在20～80 μg/mL 范圍內線性良好，R2=0.999 34， 且不受其他氨基酸的干擾， 樣品平均回收率為101.5%，RSD=1.08%。 經過與高效液相色譜（HPLC）方法對比，該方法精密度與HPLC 法檢測的結果基本一致，誤差在2%以內，顯色穩定，結果準確且不受其他氨基干擾，適合L-色氨酸含量的快速檢測。

2.3 近紅外光譜儀技術

近紅外光譜（near infrared spectroscopy，NIRS）技術具有測定速度快、成本低等優勢，廣泛應用于飼料樣品水分、蛋白質、氨基酸等指標的快速定量測定［25］。 其原理是利用近紅外光照射到有機物質的含氫基團（C-H、N-H、O-H、S-H 等），使其在可見區和中紅外區之間 （波長780～2 500 nm 區域）躍遷時產生明顯光譜變化， 借助化學計量學建立化學值與近紅外光譜的吸光度或光密度值之間的校正模型， 利用校正模型代替常規化學方法對未知樣品進行預測， 實現樣品中多種成分含量的測定［26-27］。

湖南省地方標準《飼料中氨基酸的測定 近紅外法》（DB 43/T 1065—2015）中利用氨基酸中的含氫化學鍵在近紅外區具有特定的倍頻和合頻吸收帶，獲得其在近紅外區的吸收光譜，通過主成分分析、偏最小二乘法等化學計量學手段，建立飼料樣品近紅外光譜測定氨基酸含量的線性或非線性模型， 從而實現利用飼料樣品的近紅外光譜信息快速測定氨基酸含量。 張斌等［28］運用近紅外谷物分析儀在波長1 100～2 498 nm， 對飼料樣品進行近紅外光譜掃描， 發現運用改良的偏最小二乘法的全局定標方法和局部飛速定標方法預測色氨酸含量效果最好，方程預測標準誤差低，外部驗證結果準確，可用于色氨酸定量分析。 Fontaine 等［29］開發了近紅外反射光譜（NIRS）校準方法，可以準確快速地預測大豆、菜籽粕、葵花籽粕、豌豆、魚粉等1 000 多種飼料原料中包括色氨酸在內的多種必需氨基酸含量， 并給出了詳細的數據和圖形以表征獲得的校準方程式。 NIRS 預測與參考結果相比非常吻合，相對平均偏差低于5%。NIRS 可以提高飼料配方的精準度，從而提高混合飼料的質量。

3 色譜儀法

3.1 液相色譜儀

3.1.1 氨基酸自動分析儀 氨基酸自動分析儀利用經典的茚三酮柱后衍生法來定量分析水解蛋白中的氨基酸。 其分離柱采用Na+型（或Li+型）磺酸基強酸型陽離子交換樹脂， 與每種氨基酸有不同反應，不同的氨基酸有不同的分離時間。樣品中的氨基酸吸附在分離柱的樹脂上， 因緩沖液的pH值、離子強度、分離柱溫度不同而使各種氨基酸得以分離，在微酸性的熱溶液中，茚三酮與色氨酸發生氧化、脫氨和脫羧作用，生成的氨基與茚三酮、還原茚三酮作用生成可以被分光光度計檢測的紫色化合物，在570 nm 處有最大吸收，顏色深淺與色氨酸含量成正比， 對比標準樣品即可對未知樣品中的色氨酸進行定性定量檢測［19］。 該儀器具有自動化程度高、重現性好、結果可靠等多項優點，且由于陽離子交換柱對氨基酸進行了分離純化，避免了其他物質對色氨酸衍生化的干擾， 適用于大量樣品的分析［30］。

《飼料中氨基酸的測定》（GB/T 18246—2000）采用常規堿水解， 即飼料中的蛋白質在110 ℃烘箱、4 mol/L LiOH 作用下水解20 h， 水解出的色氨酸再用氨基酸自動分析儀分離測定［31］。 陳向群等［15］采用4 mol/L LiOH、145 ℃、水解5 h 快速水解法聯合氨基酸自動分析儀測定羽毛粉中色氨酸含量，方法回收率91%，變異系數2.24%，能縮短分析時間且不影響分析結果的準確度， 與常規堿水解法所測結果基本一致。 周虹等［14］建立了用微波堿水解樣品快速測定濃縮料等農產品中色氨酸的方法，通過篩選微波堿水解的最優條件，確定樣品粒度為60 目，稱樣量20 mg，堿解劑為5 mol/L 氫氧化鈉溶液， 設置微波水解儀水解溫度90 ℃，水解時間90 min，并用氨基酸自動分析儀Na+離子流動相系統，150 mm×4.6 mm 色譜柱，57～74 ℃梯度洗脫檢測色氨酸含量， 方法回收率97.2%～101.2%，樣品RSD＜10.2%，結果準確、高效、重現性好，優于常規堿水解。

3.1.2 高效液相色譜儀 高效液相色譜法包括正相高效液相色譜法（HPLC）和反相高效液相色譜法（RPLC）。 正相高效液相色譜法中流動相的極性小于固定相的極性。 反相高效液相色譜法中流動相的極性大于固定相的極性。 柱前衍生正相高效液相色譜法的原理是先用衍生試劑將氨基酸轉化為具有可見光、 紫外生色團或者能產生熒光的衍生物， 再通過紫外、 熒光等檢測器測定氨基酸含量，其優點是衍生條件可以任意選定、衍生化副產物干擾減少、生化反應溶劑不用匹配流動相、衍生反應完全。 柱前衍生反相高效液相色譜是反相鍵合高效液相色譜 （RPLC） 和柱前衍生技術的結合［32］。這兩種方法的關鍵都在于衍生劑的選擇，衍生劑需具備穩定性強、結合性好、衍生反應條件溫和、毒副作用小等優點。常用的衍生劑有鄰苯二甲醛（OPA）、丹酰氯（Dansyl-Cl）、9-氯甲酸芴甲酯（FMOC）、異硫氰酸苯酯（PITC）和6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺碳酸鹽（AQC）等［33］。

《飼料中色氨酸的測定》（GB/T 15400—2018）建立了飼料中色氨酸含量測定的高效液相色譜法。在流動相為乙酸鈉緩沖液和甲醇、色譜柱柱溫為室溫、檢測波長280 nm 等色譜條件下，飼料中的色氨酸與雜質成分分離效果好，峰形理想，具有較高的靈敏度和精密度， 能夠滿足飼料中色氨酸的定量分析［23］。 趙艷等［9］通過測定魚粉、豆粕樣品中色氨酸含量建立了微波輔助蛋白質水解—反相高效液相色譜的方法，樣品經微波堿水解后，采用C18色譜柱，以0.05 mol/L KH2PO4溶液—乙腈為流動相進行洗脫，二級陣列管（DAD）檢測器在220 nm 處進行檢測， 色氨酸線性相關系數為1.000 0，回收率93.0%～95.5%，RSD 為1.26%～2.72%，很好地解決了苯丙氨酸、 酪氨酸等帶苯環氨基酸對色氨酸測定結果的干擾問題。李成成等［34］采用C18高效液相色譜柱分離麥麩、 玉米等飼料樣品堿水解液，醋酸鹽緩沖液和甲醇為流動相等度洗脫，DAD檢測器在280 nm 波長檢測； 標準曲線在25～500 mg/L 線性良好， 加標回收率為88.33%～105.04%，相對標準偏差也較小。 高效液相色譜法測定飼料中色氨酸含量具有方法準確、分析時間較短、靈敏度高等優點，適用于飼料中色氨酸大規模測定。

3.2 氣相色譜儀

氣相色譜法（gas chromatography，GC）是利用氣體作為流動相的色層分離分析方法。 通過選擇氯甲酸甲酯（MCF）、三氟乙酰（TFA）、五氟丙酰（PFP）、七氟丙酰（HFB）等作為衍生劑，將氨基酸衍生為易于氣化的衍生物， 將氣化后的氨基酸由氣體流動相攜帶通過色譜柱， 通過與固定相結合能力的不同形成差速遷移， 從而實現各個氨基酸組分的分離，具有效能高、靈敏度高、選擇性強、分析速度快、應用廣泛、操作簡便等優點，但其衍生化反應容易受到干擾成分的影響［30］。因此，單獨的GC 法在氨基酸的分析中應用并不多。相對于GC，氣相色譜—質譜聯用儀（GC-MS）結合了氣相色譜和質譜的特性， 將待測氨基酸樣品在氣相色譜儀中進行分離后直接導入質譜儀進行檢測， 極大地提高了氨基酸定量分析效率［35］。

孟慶國等［36］將沼液作為飼料添加劑并研究其氨基酸含量，采用柱前衍生氣相色譜法，聯合質譜儀測定7 種沼液中包括色氨酸在內的18 種游離蛋白氨基酸含量，由于氨基酸R 基不同，各種氨基酸的化學性質也有較大差異， 測定多種不同屬性的氨基酸存在一定困難；運用GC-MS 法分析多種不同氨基酸， 能夠更為有效地分離色氨酸等不同種類的氨基酸，測定結果準確，回收率＞90%，且方法簡便、低耗、重現性好。

3.3 毛細管電泳儀

毛細管電泳 （capillary electrophoresis，CE）是經典電泳技術和現代微柱技術結合的產物， 能在高壓電場驅動下， 以內徑僅25～100 μm 的毛細管為分離通道， 根據樣品各組合之間電泳淌度或分配行為上的差異而實現分離目的的一類液相分離技術， 根據其分離組分特性不同可分為毛細管區帶電泳、膠束毛細管電泳、毛細管凝膠電泳、毛細管等速電泳等不同模式［37］。 毛細管電泳中使用的檢測方法有光譜法、電化學法、電導法和質譜法，紫外可見光譜法最普遍。 該方法在3～30 min 內即可實現結果測定，具有分離效率高、分析速度快、所需樣品量和溶劑消耗少、運行成本低、對環境污染小、靈敏度高、高度自動化等特點，已廣泛應用于氨基酸分離及含量測定［38］。

《飼料中氨基酸的測定毛細管電泳法》（NY/T 3001—2016）中飼料樣品經過鹽酸水解后，經異硫氰酸苯酯溶液（PITC）衍生，再用毛細管電泳法進行分離和定量，但不適用于色氨酸測定［39］。俄羅斯標準《毛細管電泳法測定飼料、配合飼料及飼料原料中的蛋白氨基酸的含量》（GOST R 55569—2013）中飼料色氨酸含量測定：采用Ba（OH）2于110 ℃水解14～16 h 后， 不需衍生直接用硼砂緩沖液電泳并在219 nm 波長下測定色氨酸含量。 陶玉貴等［40］采用高效毛細管區帶電泳法配套二極管陣列檢測器對發酵液中L-色氨酸的含量進行了測定，通過對檢測波長、緩沖液pH 值、緩沖液濃度、分離電壓等測定條件進行篩選， 發現使用pH 值9.5、40 mmol/L 硼砂緩沖液，在25 kV 下電泳分離、210 nm 波長下檢測L-色氨酸的測定結果最佳。毛細管電泳儀測定L-色氨酸的檢測限為1.389 μmol/L，相對標準誤差為3.308%，平均加標回收率為101.26%。 該方法具有準確度高、檢測速度快等優點，可用于測定L-色氨酸的含量。 郗娟等［41］基于［Ru（phen）32+］-Ce（Ⅳ）化學發光體系，提出了毛細管電泳—化學發光聯用技術檢測復方氨基酸溶液中色氨酸的新方法。 在對電泳條件及柱后化學發光檢測條件進行優化處理后， 該方法測定色氨酸的線性范圍為5.0×10-7～2.0×10-5mol/L， 檢測限為7.6×10-8mol/L， 出峰時間和電泳峰高的相對標準偏差分別為1.0%、4.7%，結果準確。

4 小結

隨著人們對L-色氨酸的重視程度越來越高，用于色氨酸檢測的眾多技術，如前處理方法、光譜法、色譜法等在檢測準確度、精密度、自動化測定方面不斷革新。但也存在諸多問題，如在氨基酸的分離測定方法中， 采用分光光度及熒光法測定色氨酸含量靈敏度低、雜質干擾強，液相色譜法操作復雜、影響因素多，毛細管電泳法分辨率及選擇性低，氨基酸自動分析儀昂貴、運行費用高。 色氨酸檢測技術未來的研究趨勢可以將多種檢測技術融合、取長補短，開發普遍適用、準確快捷的飼料中色氨酸檢測技術。