驢骨膠原肽制備方法的初步建立及分子量檢測

付改玲，劉厚霞，王 娟，劉永清，李小波，夏 敏

（內蒙古元本生物醫藥科技有限公司，內蒙古 呼和浩特 010010）

我國是世界上驢存欄量最多的國家， 年存欄量約為1 000 萬頭。 驢的性情溫順、耐受力強、壽命長、采食量小，集藥、補、食三大功能于一體。 驢皮自古以來就有很高的藥用價值，是制作“國藥瑰寶”阿膠的主要原料。驢骨與驢皮含有同樣的骨膠原蛋白肽類物質，具有與阿膠相同的補血養顏、調節腸胃功能、增強免疫力的功效［1-2］。 驢骨還具有強筋健骨、防治骨質疏松癥等功效［3］。

目前， 動物骨膠原蛋白提取方面的研究主要集中在牛、羊、雞、豬等動物［4-5］，而驢骨膠原蛋白多肽的研究與產品開發尚處于空白階段。 隨著驢產業的發展越來越受到人們的關注， 驢骨膠原肽產品的開發也成為提高驢產業附加值的一個重要方向。該研究旨在通過模擬人工胃腸環境，采用二級生物酶解技術提取驢骨膠原蛋白多肽， 并對其分子量進行檢測， 以期為開發適合人體吸收分子量的驢骨膠原肽原料以及后續產品的研發提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

驢骨，呼和浩特市蒙驢食品有限公司提供；胃蛋白酶（10 萬U/g）（貨號：9001-75-6）、胰蛋白酶（4 000 U/g）（貨號：T8151）、Tricine（貨號：T8190），購自北京索萊寶科技有限公司；牛血清白蛋白（貨號：PB10056），購自北京普博欣生物科技有限責任公司；福林酚（貨號：73104861），購自國藥集團化學試劑有限公司； 丙烯酰胺（貨號：A108465-500 g）、N，N-亞甲基丙烯酰胺（貨號：M104026-25 g），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；β-巰基乙醇（貨號：R049953-25 mL），羅恩試劑產品；Tris堿（貨號：Amresco 0497），BIOSHARP 產品；小分子蛋白預染Marker（貨號：26628），購自Thermo Scientific 公司；五水硫酸銅、氫氧化鈉、碳酸鈉、酒石酸鉀、溴酚藍、考馬斯亮藍R250、過硫酸銨、硫酸銨、無水乙醇、冰乙酸、尿素。

1.2 主要儀器設備

破骨機，膠體磨，骨泥磨，高壓滅菌鍋，培養箱，搖床，數顯恒溫水浴鍋，離心機，雙光束紫外分光光度計，TVE-1100 濃縮干燥機，BYGENE 電泳儀，超純水機，移液槍。

1.3 試驗方法

1.3.1 驢骨的預處理 將新鮮的驢骨去除骨膜，剝去殘留的肌肉、脂肪和筋膜，經過破骨機破碎為5 cm 左右的小骨渣后送清洗機清洗。 將清洗后的驢骨渣瀝干、稱重，于膠體磨和骨泥磨中制成驢骨泥（骨泥細度90～100 目），含水量60%～70%。 脫脂［6-7］：取一定量的骨泥，加入2 倍純化水，于高壓滅菌鍋內高溫高壓熬煮（121 ℃、45 min），去除上油層。 脫鈣［8］：將脫脂后的骨泥加入0.5%EDTA 溶液，浸泡24 h，100 r/min 攪拌，每8 h 更換1 次溶液，進行脫鈣處理。

1.3.2 驢骨膠原肽的提取

1.3.2.1 一級酶解 將脫脂、脫鈣后的骨泥按1∶3（W∶V）的比例加入純化水，模擬人工胃液，用2.0 mol/L 的鹽酸溶液調節pH 值至2.5～3.0，加入不同比例（1.0%、2.0%、3.0%）的胃蛋白酶（占驢骨的百分比）， 按胃蛋白酶最適酶活性進行酶解處理，時間為1.5、2.0、2.5 h。升溫至100 ℃，作用15 min，使酶滅活，得到一級酶解液。 取樣，用0.45 μm 的濾膜過濾，過濾液用于測定驢骨膠原肽含量。

1.3.2.2 二級酶解 選取驢骨膠原肽含量較高的一級酶解液，模擬人工腸液，用磷酸鹽緩沖液調節pH 值至7.5～8.0， 加入不同比例 （1.0%、2.0%、3.0%）的胰蛋白酶（占驢骨的百分比），（50±0.5）℃條件下酶解處理， 時間為1.5、2.0、2.5 h。 升溫至100 ℃，作用15 min，使酶滅活，得到二級酶解液。

二級酶解后獲得的酶解液10 000 r/min 離心20 min，取上清液，用0.45、1.0、3.0 μm 的濾膜分級過濾，得到驢骨膠原肽溶液。

1.3.3 驢骨膠原肽含量的測定

應用福林酚法測定驢骨膠原肽溶液的多肽含量。

1.3.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取牛血清白蛋白對照品0.03 g，加水至100 mL，制成1.0 mL 含牛血清白蛋白0.3 mg 的溶液。

1.3.3.2 堿性銅溶液的配制 取氫氧化鈉10 g、碳酸鈉50 g，加水400 mL 使其溶解，作為甲液。 取酒石酸鉀0.5 g 加水50 mL 使其溶解， 另取硫酸銅0.25 g 加水30 mL 使其溶解， 二者的混合液作為乙液。

臨用前，合并兩液，得到堿性銅溶液，加水至500 mL。

1.3.3.3 待檢樣品的制備 取制備的驢骨膠原肽溶液1.0 mL 加入50 mL 量瓶，加水定容至50 mL，作為待檢樣品，做3 個平行。

1.3.3.4 標準曲線的繪制 精密量取 “1.3.3.1”項下制備的對照品溶液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL，分別置于具塞刻度試管中，各加水至1.0 mL，再分別加入堿性銅溶液1.0 mL，搖勻，各加入福林酚試液4.0 mL，立即混勻，55 ℃水浴10 min，在650 nm波長處測定吸光度；以0 號管作為空白對照，以吸光度作為縱坐標、 對照品溶液濃度作為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.3.5 待檢樣品多肽含量的測定 精密量取“1.3.3.3” 項下的驢骨膠原肽待檢樣品1.0 mL，測定在650 nm 波長處的吸光度，自標準曲線上查得待檢樣品溶液的多肽濃度，并乘以稀釋倍數，即為所制備驢骨膠原肽溶液的多肽含量。

1.3.4 驢骨膠原肽分子量的測定［9-11］驢骨膠原肽分子量的測定采用SDS-PAGE法，步驟如下。

1.3.4.1 溶液的配制 30%丙烯酰胺： 丙烯酰胺29.0 g、 甲叉雙丙烯酰胺1.0 g， 加蒸餾水定容至100 mL。 陽極緩沖液：取Tris 12.11 g，加蒸餾水至500 mL，用鹽酸調整pH 值至8.9，定容至500 mL。陰極緩沖液： 取Tris 6.06 g，Tricine 8.96 g，SDS 0.5 g，加蒸餾水定容至500 mL。 分離膠緩沖液：取Trisbase 180 g，加蒸餾水800 mL 溶解，用鹽酸調整pH值至8.8， 定容至1 000 mL。 濃縮膠緩沖液：取Tris-base 60 g，加蒸餾水800 mL 溶解，用鹽酸調整pH 值至6.8，定容至1 000 mL。 樣品緩沖液：取SDS 0.8 g， 甘油4.0 g，β-巰基乙醇0.2 g， 溴酚藍0.01 g，加0.5 mol/L 的Tris-HCl（pH 值=6.8）溶解，并定容至10 mL。 25%過硫酸銨溶液：取過硫酸銨2.5 g， 加蒸餾水定容至10 mL。 10%SDS 溶液：取SDS 10 g，加蒸餾水定容至100 mL。 染色液：取考馬斯亮藍R250 2.5 g， 無水乙醇400 mL， 冰乙酸100 mL，加蒸餾水定容至1 000 mL。 脫色液：取無水乙醇300 mL，冰乙酸100 mL，加蒸餾水定容至1 000 mL。

1.3.4.2 制膠 采用BYGENE 垂直電泳儀附件模具， 制成0.75 mm 厚的凝膠， 分別制成20%分離膠、10%夾層膠、5%濃縮膠的梯度膠， 各梯度凝膠配方見表1。3 種膠的制膠體積比為4.0∶1.5∶1.0，分離膠與夾層膠制成后，小心注入純化水封膠，待膠聚合完全后，傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。

1.3.4.3 樣品處理 取2 mL 樣品原液加入濃縮管，于試管濃縮儀中55 ℃、-80～-70 kPa 濃縮干燥成粉，得到濃縮樣品。 樣品濃縮物中加入1 mL 上樣緩沖液，熱水煮沸5 min。

1.3.4.4 點樣 小分子預染蛋白Marker 與樣品各點入15 μL，含小分子肽15 μg 左右。

1.3.4.5 跑膠 前3 h 電壓50 V、 電流20 mA，后2 h 電壓90 V、電流30 mA。

1.3.4.6 固定 取膠加入固定液固定20 min，用純化水反復清洗干凈。

1.3.4.7 染色 加入染色液染色30 min。

1.3.4.8 脫色 棄去染色液，加入脫色液，在搖床上60 r/min 脫色40 min，用純化水反復清洗干凈。

1.3.4.9 結果觀察 用肉眼觀察蛋白條帶。

1.4 數據處理

人工胃液和腸液模擬條件下， 不同加酶量和酶解時間作用后的一級、 二級酶解驢骨膠原肽含量數據用“平均值±標準差”（Mean±SD）表示。 利用SPSS 17.0 軟件對試驗數據進行方差分析， 采用LSD 法進行多重比較。 P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 標準曲線方程

利用福林酚法測得不同濃度標準品牛血清白蛋白的吸光度。根據所測結果，以標準品濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線（見圖1），得到標準曲線方程：y=0.163 9x-0.149 6，R2=0.998 9。

圖1 不同濃度牛血清白蛋白標準曲線

2.2 一級酶解驢骨膠原肽含量測定結果

由于一級酶解模擬的是人工胃液環境（pH 值在2.5～3.0）， 酶解反應條件以加酶量和酶解時間作為變量， 酶解后驢骨膠原肽含量作為酶解率評價指標的因變量。 應用福林酚法測得一級酶解驢骨膠原肽吸光度。 根據標準曲線方程y=0.163 9x-0.149 6（R2=0.998 9）及稀釋倍數，得出一級酶解驢骨膠原肽含量。應用SPSS 17.0 軟件，對不同加酶量和酶解時間處理的一級酶解驢骨膠原肽含量進行方差分析和組間多重比較，結果見表2。 由表2 可知，在相同酶解時間下，加酶量為2.0%和3.0%時，所得的一級酶解驢骨膠原肽含量均極顯著（P＜0.01）高于加酶量為1.0%時的一級酶解驢骨膠原肽含量，而加酶量為2.0%和3.0%時所得的一級酶解驢骨膠原肽含量差異均不顯著（P＞0.05），提示加酶量為2.0%和3.0%時獲得的一級酶解驢骨膠原肽含量較高。 當加酶量為2%和3%時，酶解2.0 h 和2.5 h 時所得的一級酶解驢骨膠原肽含量均極顯著（P＜0.01）高于酶解時間為1.5 h 時的一級酶解驢骨膠原肽含量， 而酶解2.0 h 和2.5 h 時所得的一級酶解驢骨膠原肽含量差異均不顯著 （P＞0.05），提示酶解時間為2.0 h 和2.5 h 時獲得的一級酶解驢骨膠原肽含量較高。 結合統計學分析結果，從保證酶解產物獲得量、降低胃蛋白酶使用成本和縮短酶解時間的角度考慮， 胃蛋白酶的最適添加比例為2.0%，最適酶解時間為2.0 h。 由此可以得出，模擬人工胃液環境，應用胃蛋白酶進行一級酶解驢骨膠原肽的最適反應條件為：pH 值在2.5～3.0，加酶量2.0%、酶解時間2.0 h。

表1 不同濃度凝膠配方

2.3 驢骨膠原肽含量測定結果

選取最適一級酶解條件所得酶解液， 模擬人工腸液環境（pH 值在7.5～8.0）進行二級驢骨膠原肽酶解， 酶解反應條件及酶解評價指標與一級酶解相同。二級酶解液即為驢骨膠原肽溶液，應用福林酚法測得二級酶解驢骨膠原肽吸光度。 根據標準曲線方程y=0.163 9x-0.149 6（R2=0.998 9）及稀釋倍數， 得出二級酶解驢骨膠原肽含量。 應用SPSS 17.0 軟件，對所得數據進行方差分析和組間多重比較，結果見表3。 由表3 可知，在相同酶解時間下，加酶量為2.0%和3.0%時，所得的驢骨膠原肽含量均極顯著（P＜0.01）高于加酶量為1.0%時的驢骨膠原肽含量，而加酶量為2.0%和3.0%時所得的驢骨膠原肽含量差異均不顯著 （P＞0.05），提示加酶量為2.0%和3.0%時獲得的驢骨膠原肽含量較高。當加酶量為2.0%和3.0%時，酶解2.5 h 所得的驢骨膠原肽含量均顯著 （P＜0.05） 高于酶解2.0 h 所得的驢骨膠原肽含量， 且均極顯著 （P＜0.01） 高于酶解1.0 h 所得的驢骨膠原肽含量，提示酶解2.5 h 時獲得的驢骨膠原肽含量最高。結合統計學分析結果，從保證酶解產物獲得量、降低胰蛋白酶使用成本和縮短酶解時間的角度考慮，胰蛋白酶的最適添加比例為2.0%， 最適酶解時間為2.5 h。 由此可以得出，模擬人工腸液環境，應用胰蛋白酶進行二級酶解驢骨膠原肽的最適反應條件為：pH 值在7.5～8.0，加酶量2.0%、酶解時間2.5 h。

2.4 驢骨膠原肽分子量測定結果

由圖2 可知， 通過二級生物酶解技術獲得的驢骨膠原肽分子量在10 kDa 左右。

3 討論

該研究針對內蒙古自治區牲畜骨骼資源利用不足，營養物質提取率低，且多在加工過程中使用酸性裂解等工藝，易造成環境污染等問題，探索了驢骨膠原肽的新型制備工藝。 通過模擬人工胃腸液消化環境， 建立了驢骨膠原肽二級生物酶解制備工藝及條件。 首先將新鮮驢骨制成骨泥，脫脂、脫鈣處理后，加水加酶，進行一級酶解。 酶解條件為：添加2.0%胃蛋白酶（10 萬U/g），pH 值在2.5～3.0，酶解時間2.0 h。 一級酶解完成后，調節pH 值在7.5～8.0，添加2.0%胰蛋白酶（4 000 U/g），酶解時間2.5 h， 即完成二級酶解。 之后， 利用SDSPAGE 法分析了二級生物酶解所得驢骨膠原肽的分子量，產物大小集中于10 kDa。 綜上表明，該研究在模擬人體胃、腸生理環境條件下，采用二級生物酶解制備方法可生產符合人體吸收和生物學作用的驢骨膠原肽。

表2 不同加酶量與酶解時間所得一級酶解驢骨膠原肽含量測定結果（Mean±SD，n=5） 單位：mg/mL

表3 不同加酶量與酶解時間所得驢骨膠原肽含量測定結果（Mean±SD，n=5） 單位：mg/mL

圖2 SDS-PAGE 法分析驢骨膠原肽分子量結果

新鮮驢骨骨骼密度大，骨質優良，骨骼中蘊藏的膠原蛋白含量大， 是小分子骨膠原肽提取的理想原料， 為活性小分子肽的提取提供了一個天然的寶庫。 驢骨膠原蛋白的開發正成為提高驢產業附加值的一個方向。 該研究結果可為驢骨膠原肽的開發和利用提供技術參考。