馬早期流產相關功能基因挖掘的研究

吳海青，劉 威，馬躍軍，蘇少鋒，薩初拉，付紹印，高文淵，李玉榮

（1.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010031；2.內蒙古自治區草原工作站，內蒙古 呼和浩特 010018）

流產是造成馬繁殖率降低的重要原因。 據報道，舍飼馬流產率約為10%，群牧馬流產率更高，可達30%［1］。 馬匹流產中早期流產占比最大，達到88%。 在相同飼養環境下，馬群中總是存在少數配種后45 d 以內通過直腸檢查胚胎正常發育，但在2～4 個月后出現流產的現象， 該現象也造成馬匹發情觀察延誤，導致馬匹空懷［2］。 早期流產的影響因素較多，包括營養水平、繁殖疾病、細菌病毒感染、激素水平變化、胚胎著床等［3］。 對馬而言，營養水平、 繁殖疾病和細菌病毒感染等外源因素引起的流產，可以通過提高飼養管理水平、藥物治療和環境消毒等措施避免。但激素分泌、胚胎著床等內源性因素與相關基因的表達密切聯系， 是較難解決的， 通常這部分馬匹在調整馬群結構過程中被逐步淘汰。

胚胎著床的分子機理較為復雜。 參與胚胎著床的相關因子包括細胞黏附分子、鈣黏分子、免疫球蛋白超家族細胞因子、表皮生長因子、細胞集落刺激因子等［4］。 參與胚胎著床的信號通路有Wnt信 號 通 路［5-6］、整 合 素 信 號 通 路［4］、MAPK 信 號 通路［7］、晝 夜 節 律 信 號 通 路［8］、鈣 離 子 信 號 通 路［9］、Notch 信 號 通 路［10］等。 王 健［11］研 究 發 現E4BP4、RGS2、ISP2、MNSFβ、EMO-1、EMO-2 等基因與小鼠胚胎著床顯著相關。 促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH） 除了促進卵母細胞發育成熟，還對胚胎著床有重要作用。研究表明，GnRH 受體 （gonadotropin-releasing hormone receptor，GnRHR）被GnRH 激活后，會提高滋養層細胞分泌絨毛膜促性腺激素的水平， 從而促進胚胎著床；GnRH 也可以顯著提高雌激素的分泌水平，同時提升黃體分泌孕酮的水平，從而促進胚胎發育［12］。

早期流產是制約馬產業發展的重要因素。 目前關于馬匹早期流產或胚胎著床的相關基因鮮有報道。 該研究通過對發生早期流產的母馬和正常分娩的母馬進行基因組測序分析， 以期挖掘與早期流產或胚胎著床相關的SNP 及功能基因， 為揭示引起馬匹早期流產的原因提供生物信息學方面的參考數據。

1 材料與方法

1.1 試驗用馬選擇與分組

2018 年6 月，在內蒙古可汗御馬苑有限公司進口馬純繁群中選擇配種后45 d 能夠檢查到胚胎， 但2～4 個月后發生流產的母馬10 匹 （流產組），以及能正常分娩的母馬10 匹（分娩組）。兩組馬匹的飼養管理條件一致。 所有母馬年齡5～14歲，均為參配母馬，無繁殖疾病，品種為走馬和純血馬。 試驗用馬的基本信息見表1。

1.2 全基因組提取及測序

1.3 全基因組重測序數據處理

利用FastaQC（version 0.10.1）對數據質量進行評估，質控過濾后的測序reads 通過BWA 軟件比對到馬參考基因組（ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-91/fasta/equus_caballus/dna/Equus_caballus.EquCab2.dna_sm.toplevel.fa.gz）， 應用SAMtools 軟件對比對結果進行排序； 然后用Picard 標記重復序列，使用GATK 和SAMtools 軟件，分別將比對后得到的bam 文件在含有插入或缺失突變的區間進行區域內重新比對， 最后獲得所有試驗個體的單核苷酸多態位點（SNP）和短插入缺失（INDEL）數據集。 利用var 命令分別鑒定Germline SNV 和INDEL， 利用Manta 算法鑒別Germline SV， 利用Control-Freec 算法鑒別Germline CNV。

表1 試驗用馬的基本信息

1.4 選擇信號檢測

以不同的性狀進行分組， 在全基因組范圍內進行選擇性消除分析。 在常染色體上使用100 kb大小的窗口進行掃描， 對每個窗口計算Fst 值；同時， 以相同大小的滑動窗口對2 個群體進行堿基多態性π 值的計算， 檢測受選擇的區域。 將通過Fst 值和π 值分析得到的區域進行聯合分析。

1.5 選樣區域的候選基因注釋、GO 分析和通路分析

對鑒別出的被選擇區域進行注釋， 找出區域內的基因。進一步對基因進行功能注釋，得到基因對應的GO term 及信號通路富集。

2 結果與分析

2.1 全基因組重測序

試驗用馬經基因組重測序共獲得501 Gb 的有效數據， 以及3.64×109個reads，96%以上的reads 100%對應到參考基因組上；每匹馬基因組的平均序列覆蓋率為97%，GC 含量平均占比47.2%；單核苷酸多態性（SNPs）為每匹馬4.2×106個（見表2）。

2.2 選擇性消除與候選基因篩選

通過流產組和分娩組SNP 比對Fst 分析，共有1 381 個SNP 位點（見圖1）。 π 分析共有1 614個SNP 位點（見圖2）。 聯合分析得到203 個SNP位點，過濾掉突變基因間區域、非編碼區域、內含子和同義SNV 后得到82 個SNP 位點，定位于69個基因上（見圖3）。 通過GO term、信號通路富集分析及參閱文獻，篩選出其中的12 個基因為馬早期流產和胚胎著床的重要候選基因，包括TGIF1、RORB、RICTOR、Pts、MAML3、LHCGR、GNRH1、Erc1、EIPR1、DHRS4、PRKACB 和BCO1（見表3）。

3 討論

馬匹早期流產多數是由于胚胎不能著床或發育停滯引起的。 著床是胎生哺乳動物的胚泡和母體子宮壁結合， 從而建立母子間結構上的聯系以實現物質交換的過程。著床的條件包括：透明帶消失；胚泡細胞滋養細胞分化出合體滋養細胞；胚泡和子宮內膜同步發育且功能協調； 有足夠水平的孕酮，子宮有一個極短的敏感期允許受精卵著床。這些過程需要激素的精準調控， 以及相應信號通路的調節， 以保證胚泡和子宮內膜同步發育以及胎兒著床繼續發育。

表2 試驗用馬基因組重測序數據

圖1 流產組和分娩組比對Fst 分析

圖2 流產組和分娩組比對π 分析

GnRH 是由下丘腦分泌的一種生殖激素，是由10 個氨基酸組成的肽段。 GnRH 在哺乳動物中有3 個亞型：GnRH1、GnRH2 和GnRH3。 GnRH1的主要作用是刺激絨毛膜促性腺激素的釋放。GnRH 通過結合腦垂體上的GnRHR，促進黃體生成素和卵泡刺激素的分泌， 隨后刺激性腺分泌相關的甾類激素。GnRHR 是有7 個跨膜域的G 蛋白偶聯受體。 越來越多的研究證實，GnRHR 不僅在腦垂體表達，在雌性生殖器官中也有表達，如子宮肌層、子宮內膜、卵巢、胎盤、乳腺等［13］。 李穎等［12］報道，GnRH/GnRHR 系統參與胚胎著床和早期發育，具有調節子宮內膜、胎盤、卵巢功能以及支持黃體等作用。 子宮中雌激素和孕激素受體的表達受到晝夜節律調節。 孕酮與子宮內膜孕激素受體作用促使內膜細胞分化至分泌期， 利于胚胎的著床。 RORB 基因是RORs 基因家族的成員，該家族的轉錄具有節律性，可以控制晝夜節律基因Bmal的表達， 小鼠缺失RORB 基因導致生物鐘節律異常。 晝夜節律相關基因直接或間接影響GnRH 的陣發性分泌， 從而調節下丘腦—垂體—卵巢軸的內分泌功能［14］。 由此可知，RORB 基因突變會影響內分泌軸功能，在胚胎著床調節中具有重要作用。因此， 該研究中篩選出的RORB 和GNRH1 基因可能是胚胎著床的重要候選基因。

圖3 流產組和分娩組比對Fst 和π 聯合分析

表3 馬早期流產候選基因

胚胎著床需要通過多條信號通路促進胚胎發育以及改善子宮內膜容受性來實現。 哺乳動物的雷帕霉素靶蛋白 （mammalian target of rapamycin，mTOR） 是一種進化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶， 屬于磷脂酰肌醇激酶相關激酶（phosphatidylinositol kinase-related kinases，PIKKs）家族成員。 mTOR 結構復雜，有2 種形式的復合物，即mTORC1 和mTORC2。 mTORC1 含有底物募集的特異性正向調節因子raptor，mTORC2 含有特異性亞基rictor［15］。 文乙先等［16］研究發現，子宮內膜條件性敲除rictor 后，由于容受性降低導致胚胎的植入率明顯下降。有研究表明，小鼠植入期子宮內膜組織的mTOR 呈現高表達，且具有時空特異性，孕鼠圍植入期注射mTOR 抑制劑可導致胚胎丟失。研究人員對懷孕母豬子宮內膜mTOR 的下游效應物表達的測定結果顯示，真核起始因子4E 蛋白表達水平在胚胎植入期（PD13）升高，在胎盤形成期（PD24） 子宮內膜與胎盤接觸部位表達水平降低。多項動物研究結果提示，mTOR 信號通路在胚胎植入期的子宮組織表達水平升高， 并對維持成功植入以及胚胎早期發育至關重要［17］。

轉化生長因子-β （transforming growth factorβ，TGF-β）是一類在結構上相對保守的生長因子，是細胞增殖、分化，細胞外基質合成和細胞凋亡的主要調節因子之一，參與胚胎著床過程。TGF-β 信號通路參與子宮內膜容受性的形成和黏附反應，有助于滋養層侵入［18］。裴琛琳等［19］研究表明TGFβ 與轉化生長影響因子 （transforming growth interacting factor，TGIF）的異常表達可能導致子宮內膜異位癥的發生。 MAML3 參與Notch 信號通路，通過細胞與細胞的接觸而激活， 可調節細胞內多種生命進程，如增殖、分化、凋亡、侵襲、黏附等［20］。Notch 家族成員表達于子宮內膜、 胚泡和胎盤中，參與著床和胎盤形成，Notch 的表達異常與胎盤形成障礙和子癇前期的發生有關［21］。 趙明智等［10］研究發現， 原因不明的復發性自然流產患者的Notch1 信號通路和Foxp3 表達下調可能阻礙CD4+T 細胞轉化為CD4+CD25+T 細胞，進而誘發免疫排斥， 誘導流產。 蛋白激酶A 催化亞單位β（PRKACB） 參與多條信號通路， 包括Wnt、Ras、MAPK、Hedgehog、鈣離子、cAMP、間隙鏈接、緊密連接、卵巢甾類激素形成、胰島素、催產素、GnRH、甲狀腺素、雌激素等，極有可能與胚胎著床密切相關。Wnt 信號通路參與子宮接受態建立、囊胚激活、胚胎著床以及子宮基質蛻膜化，對胚胎的植入起著至關重要的作用［22］。安文仲［23］研究發現MAPK 信號通路通過調控細胞骨架控制胚胎滋養層分化及囊胚成腔。 ELKS/RAB6 -interacting/CAST family member 1（Erc1）參與NF-κB 信號通路。 NF-κB 信號通路參與胚胎著床、子宮內膜侵入［24］。翟洪波［25］研究發現，TLR2、TLR4/NF-κB 信號通路很可能是引發不明原因復發性流產的一個關鍵途徑。

黃體化激素/絨膜促性腺素受體 （lutropinchoriogonadotropic hormone receptor，LHCGR）參與催乳素信號通路、 卵巢甾類激素形成和鈣離子信號通路［26］。Bachelot［27］研究發現，卵巢LHCGR 表達減少、黃體形成和黃體酮分泌不足，可導致胚胎植入失敗。同時，催乳素受體的缺乏可以導致處于排卵期的雌性小鼠不孕。 妊娠相關的催乳素家族成員包括垂體分泌的催乳素， 子宮蛻膜分泌的蛻膜催乳素， 以及胎盤分泌的催乳素樣蛋白和催乳素相關蛋白。 典型的催乳素家族成員通過催乳素受體起作用。 非典型的催乳素家族成員作為生長因子、神經遞質或免疫調節因子，以自分泌或旁分泌方式起作用。在哺乳動物妊娠過程中，催乳素家族成員發揮重要功能，它們參與母體對妊娠的適應，促進泌乳，維持黃體，促進胚胎著床和血管發生，促進細胞生長和分化，并在免疫調節中起作用［28］。

6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶 （6-pyruvoyl tetrahydropterin synthase，Pts） 基因參與葉酸生物合成過程［29］。流行病學調查研究發現，葉酸缺乏會增加胎盤早剝的風險［30］。趙艷華等［31］研究發現，在由葉酸缺乏引起的孕鼠子宮內膜蛻膜化進程異常過程中，mTOR 信號通路發揮重要的調控作用。 VA及其活性代謝產物作為人類一種必需的營養物質，參與體內許多生理過程，包括視力、生殖、生長、細胞分化、免疫功能以及胚胎發育等。 自然存在或合成的具有與VA 類似結構的化合物稱為VA 類物。 在正常的胚胎發育過程中維持恰當的VA 水平很重要，在孕期VA 缺乏或過多地應用均可導致胚胎發育異常［32］。

綜上所述， 該研究發現的候選基因直接或間接參與胚胎著床，主要通過激素調節、胚胎侵入、維生素合成代謝等三方面發揮作用。 在今后的研究中，有望通過進一步的基因功能驗證試驗，揭示所選基因與早期流產相關， 從而為研究制定馬匹早期流產的預防和治療策略， 以及繁殖新技術的開發提供參考。