電針對(duì)心肌缺血大鼠心肌泛素連接酶Fbxo32的影響

薩喆燕 許金森 萬(wàn)隆 朱小香 蘭彩蓮 葉笑然

(福建省中醫(yī)藥科學(xué)院 福建省經(jīng)絡(luò)感傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003)

中國(guó)現(xiàn)有心血管病患約2.9億，其中冠心病1 100萬(wàn)〔1〕。冠心病已成為威脅民眾健康和生命的主要疾病之一。冠心病的治療方案雖然多樣，然而主要的西藥治療存在一定副作用，手術(shù)治療又存在一定的風(fēng)險(xiǎn)性。臨床研究表明，中醫(yī)理論指導(dǎo)下的針灸治療對(duì)改善病患心肌缺血癥狀、提高生活質(zhì)量有良好的效果〔2～4〕。但是針灸治療的確切機(jī)制仍有待進(jìn)一步明晰。有研究表明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)與心血管疾病密切相關(guān)，尤其在心肌缺血、心肌肥厚等病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔5,6〕。泛素連接酶E3是UPS的關(guān)鍵酶，尤其是肌萎縮F-bxo32蛋白(Fbxo32)在心肌組織中高度表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)心肌蛋白降解發(fā)揮關(guān)鍵作用〔7,8〕。本研究通過(guò)異丙腎上腺素(ISO)注射造成的心肌缺血大鼠模型，觀(guān)察電針對(duì)心肌缺血大鼠心臟功能及心肌組織中Fbxo32 mRNA表達(dá)的影響，探討電針改善心肌缺血的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD雄性大鼠21只，8周齡，體重(250±20)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005。在福建省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度25℃，相對(duì)濕度50%～70%。

1.2儀器 小動(dòng)物麻醉機(jī)(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；多通道生理記錄儀(澳大利亞埃德公司)；全波長(zhǎng)掃描式多功能酶標(biāo)儀和Nano Drop 2000分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo 公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國(guó)ABI公司)。

1.3試劑 ISO(美國(guó)Sigma公司)；肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性檢測(cè)試劑盒(美國(guó)TSZ生物公司)；乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測(cè)試劑盒和Trizol試劑(美國(guó)Sigma公司)；SYBR Premix Ex Taq TM和Prime Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)；LncRNA 芯片由美國(guó)Arraystar 公司中國(guó)唯一代理商上海康成生物工程有限公司提供；引物由上海康成生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.4分組及造模 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法21只大鼠分為3組，即生理鹽水對(duì)照組、模型組、電針組，每組各7只。通過(guò)小動(dòng)物麻醉機(jī)，大鼠吸入異氟烷麻醉，連接多通道生理記錄儀記錄靜息狀態(tài)下大鼠心電圖(ECG)。模型組和電針組大鼠四肢內(nèi)側(cè)、背部皮下注射ISO(85 mg/kg)，24 h注射2次。造模成功的標(biāo)志為ECG表現(xiàn)出T 波由正向變?yōu)樨?fù)向或呈雙相，伴有ST段抬高。對(duì)照組皮下注射生理鹽水(85 mg/kg)，24 h注射2次。

1.5針刺方法 電針組在第2次注射ISO后24 h 開(kāi)始治療。參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》〔9〕，采用0.25 mm×13 mm 華佗牌無(wú)菌毫針，直刺左側(cè)內(nèi)關(guān)穴，深度0.1 cm，連接SDZ-Ⅱ華佗牌電針儀，調(diào)整電壓5～10 V，以針體輕微抖動(dòng)為度，頻率2/10 Hz疏密波，1次/d，每次20 min，連續(xù)5 d。模型組和對(duì)照組按同等條件抓取，不予任何治療。

1.6心肌酶CK-MB、LDH活性測(cè)定 治療結(jié)束后，大鼠經(jīng)異氟烷麻醉，腹主動(dòng)脈取血3 ml，靜置30 min 后，3 500 r/min 常溫離心15 min，提取血清，按照試劑盒說(shuō)明，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定CK-MB和LDH活性。

1.7病理學(xué)切片檢測(cè) 大鼠處死后取左心室，4%多聚甲醛溶液固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀(guān)察心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。

1.8基因芯片檢測(cè)心肌泛素連接酶E3基因 大鼠處死后取新鮮左心室組織，-80℃保存。委托上海康成生物工程有限公司進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，模型組和電針組各隨機(jī)選取3個(gè)樣本。芯片選用大鼠LncRNA芯片v2.0，在檢測(cè)LncRNAs外能同時(shí)檢測(cè)24 626個(gè)蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本。主要步驟：①參照Trizol說(shuō)明提取心肌組織總RNA，使用Nano Drop 2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度；1%變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀(guān)察檢測(cè)RNA完整性。②從總RNA中得到mRNA，用隨機(jī)引物法將樣本放大并轉(zhuǎn)錄成含熒光標(biāo)記的cRNA；將標(biāo)記好的cRNAs進(jìn)行芯片雜交、洗滌、固定。③掃描芯片，通過(guò)軟件采集探針信號(hào)值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。經(jīng)過(guò)歸一化處理，得到電針組與模型組標(biāo)記基因的差異倍數(shù)≥1.5，經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn)，P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得到差異表達(dá)的心肌泛素連接酶E3列表。

1.9q-PCR檢測(cè)心肌組織Fbxo32 mRNA表達(dá) 取各組新鮮大鼠左心室組織各7例，-80℃保存。主要步驟：①參照Trizol說(shuō)明提取心肌組織總RNA，檢測(cè)RNA濃度、純度和完整性。②逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行q-PCR反應(yīng)。PCR引物Fbxo32上游：5′GCAAAACATAAGACTCATACGGG3′，下游：5′ GGTGATCGTGAGACCTTTGAA3′，199 bp；GAPDH上游：5′ GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTA3′，下游：5′ TGGTAACCAGGCGTCCGATA3′，124 bp。③q-PCR體系：反應(yīng)總體積10 μl，其中上下游引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，q-PCR Master Mix 5 μl，dd H2O 2 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火60 s，40個(gè)循環(huán)。Fbxo32 mRNA相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用2-ΔΔCt法，GAPDH為內(nèi)參，生理鹽水對(duì)照組的均值為1。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組CK-MB、LDH活性檢測(cè) 與生理鹽水對(duì)照組比較，模型組血清CK-MB和LDH活性均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，電針組血清CK-MB和LDH活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組CK-MB、LDH活性比較

2.2各組心肌組織病理HE染色 光鏡下可見(jiàn)生理鹽水對(duì)照組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，排列整齊，胞核位于細(xì)胞中央，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組心肌組織中可見(jiàn)大量心肌纖維壞死溶解，被增生的結(jié)締組織取代，伴有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；電針組心肌組織也可見(jiàn)心肌纖維壞死溶解，被增生的結(jié)締組織代替，但病變范圍較模型組明顯減小。見(jiàn)圖1。

圖1 各組心肌組織HE染色(×200)

2.3心肌泛素連接酶E3基因芯片檢測(cè) 通過(guò)芯片篩選及文獻(xiàn)檢索比較發(fā)現(xiàn)，有20個(gè)心肌泛素連接酶E3基因有差異表達(dá)。電針組與模型組比較，表達(dá)下調(diào)的基因有15個(gè)，表達(dá)上調(diào)的基因有5個(gè)。Fbxo32基因也是其中之一，其在電針組的表達(dá)較模型組顯著下調(diào)(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 模型組與電針組心肌組織泛素連接酶E3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.4心肌組織Fbxo32 mRNA表達(dá)比較 與生理鹽水對(duì)照組(1.019±0.075)相比，模型組(1.828±0.255)心肌組織Fbxo32 mRNA表達(dá)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相較，電針組(1.247±0.059)心肌組織Fbxo32 mRNA表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。心肌組織Fbxo32 mRNA變化趨勢(shì)與芯片結(jié)果一致。

3 討 論

中醫(yī)雖沒(méi)有心肌缺血的病名，但心肌缺血的主要癥狀心悸、胸悶、胸痛等，均包含在中醫(yī)“真心痛”、“胸痹”、“厥心痛”等病癥范疇中。針灸治療心肌缺血的療效在中國(guó)古代醫(yī)典中早有記載。《針灸大成》載：“手厥陰之絡(luò)，名曰內(nèi)關(guān)。實(shí)則心痛，瀉之；虛則頭強(qiáng)，補(bǔ)之”。現(xiàn)代大量臨床實(shí)踐也證實(shí)針灸作為治療心肌缺血的輔助療法，對(duì)于改善患者的癥狀效果明確，安全性高〔2,3〕。既往實(shí)驗(yàn)研究表明針刺可明顯改善心肌缺血所致的心律失常、血清及心肌組織代謝物異常等癥狀〔10～12〕。本研究結(jié)果可見(jiàn)電針改善了大鼠心肌缺血程度。

UPS是機(jī)體內(nèi)大多數(shù)臟器，特別是心臟中蛋白質(zhì)更新及受損蛋白質(zhì)降解的主要途徑，對(duì)維持心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)有著至關(guān)重要的作用。UPS主要由泛素、蛋白酶體、泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3和去泛素化酶組成〔13〕。在人類(lèi)蛋白質(zhì)組中，約有600多個(gè)泛素連接酶E3〔14〕，并在UPS參與的蛋白水解反應(yīng)中發(fā)揮重要酶促作用，決定泛素化的多樣性和蛋白底物的特異性〔15〕。已有研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)泛素連接酶E3參與多種心肌細(xì)胞病理生理過(guò)程，如心臟發(fā)育、離子通道調(diào)節(jié)、自噬、心肌凋亡等〔6,15〕。本研究結(jié)果提示電針對(duì)心肌缺血的改善可能與UPS泛素連接酶E3的參與有關(guān)。

Fbxo32是一種心臟和骨骼肌特異性F-box蛋白，作為一種重要的泛素連接酶E3，參與了心肌肥大、心肌缺血、心力衰竭等心臟相關(guān)疾病過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，在正常小鼠各臟器組織中，F(xiàn)bxo32基因在心肌組織和骨骼肌組織中的表達(dá)遠(yuǎn)高于肝、脾、肺、腎等其他臟器組織〔16〕。在急性心肌缺血小鼠心肌組織中，F(xiàn)bxo32基因呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)，尤其在心肌缺血的第一天表達(dá)量最高，雖然在心肌缺血的第七天表達(dá)量有所減少，但仍顯著高于假手術(shù)組；而高表達(dá)的Fbxo32基因與心肌梗死后的心臟破裂密切相關(guān)〔7〕。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死患者心肌組織中的Fbxo32蛋白與健康人相比，呈升高趨勢(shì)〔5〕；此外，急性心肌梗死患者的血漿中也檢測(cè)到了高表達(dá)的Fbxo32 mRNA〔16〕。

目前，有關(guān)電針對(duì)心肌組織Fbxo32的影響鮮有報(bào)道，但針灸對(duì)骨骼肌組織Fbxo32的影響已有報(bào)道。如電針可能通過(guò)抑制Fbxo32蛋白的表達(dá)，延緩失神經(jīng)肌萎縮的同時(shí)促進(jìn)肌萎縮的修復(fù)〔17〕。電針干預(yù)可能通過(guò)調(diào)控大鼠腓腸肌組織中Fbxo32 mRNA的表達(dá)，延緩肌球蛋白重鏈的降解，進(jìn)而延緩糖尿病肌萎縮的發(fā)展〔18〕。督脈灸可能通過(guò)對(duì)UPS的調(diào)控，下調(diào)Fbxo32蛋白的表達(dá)，延緩衰老模型大鼠骨骼肌萎縮〔19〕。由此，我們推測(cè)電針可能通過(guò)調(diào)控心肌組織UPS，抑制Fbxo32 mRNA的表達(dá)，發(fā)揮抗心肌缺血的作用。