不同菌量感染大鼠尿路對尿道上皮組織CNF1、CD36蛋白表達水平的影響

金海 袁文常 詹鈾超 方容 伍慧妍 彭亮

(廣州醫科大學 1附屬第五醫院，廣東 廣州 510700；2金域檢驗學院)

尿路感染是臨床常見的感染性疾病，可由多種病原體引起，其中80%患者均由尿路致病性大腸埃希菌(UPEC)感染引起〔1〕。UPEC具有特殊的結構如菌毛、鞭毛及分泌毒力因子決定了其致病能力，黏附宿主上皮細胞的能力是致病性的最重要因素〔2〕。另外有證據表明UPEC菌量也是尿路感染的重要條件，高劑量的細菌可破壞膀胱本身的防御，大大提髙感染的成功率〔3〕。Yang等〔4〕認為細胞毒性壞死因子(CNF1)能夠下調巨噬細胞CD36的轉錄而誘導急性尿路感染炎癥反應，CNF1與CD36蛋白與尿路感染密切相關。目前尿路感染主要以藥物治療，這些藥物主要針對細菌附著、細菌毒素和蛋白酶、鐵載體、脲酶、菌毛為靶標〔5〕，抗生素為主的治療藥物具有耐藥、副作用大等局限性，因此為研發新型有效的藥物開展相關尿道感染發病機制研究具有重要的意義。本實驗通過建立大鼠尿道感染模型，旨在觀察不同菌量感染大鼠尿道對尿道上皮組織CNF1、CD36蛋白表達水平的影響，了解菌量與CNF1蛋白和CD36蛋白之間的聯系，初步探討尿道感染的可能致病機制，為今后研究UPEC的尿道感染診治提供可靠的理論基礎。

1 材料與方法

1.1主要實驗材料 實驗大鼠及菌種：6～8周齡雌性SD大鼠50只，體重為(200±10)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(湘)2020-0001，實驗符合動物倫理委員會的標準。大腸埃希菌ATCC 25922菌株購自美國模式培養物集存庫ATCC。

主要實驗試劑：無水乙醇和二甲苯均購自國藥集團化學試劑有限公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)、電鏡固定液、乙二胺四乙酸(ETDA)抗原修復液均購自谷歌生物科技有限公司，PCR引物由中國廣州銳博生物科技有限公司合成，PCR逆轉錄試劑盒購自美國Thermo公司，總RNA提取試劑盒購自中國北京百泰克生物技術有限公司，蘇木素購自美國Sigma-Aldrich公司。

主要實驗儀器：石蠟病理切片機(型號：RM2016)和超薄切片機(型號：UC7)均購自上海鐵卡儀器有限公司，移液槍(型號：KE0003087)購自Dragon公司，電子顯微鏡(型號：Tecnai G220 TWIN)購自美國FEI公司，光學顯微鏡(型號：TS2)購自日本寧康生物公司。逆轉錄擴增儀購自美國Bio-Rad公司，實時熒光定量PCR儀(型號：7500)購自美國ABI公司，紫外分光光度計(型號：Nano Photometer)購自德國Implen公司。臺式高速離心機購自美國Eppendorf Centrifuge公司，組織勻漿儀購自北京柏萊斯特科技有限公司，凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2菌種復蘇和計數 取凍存的菌株接種于LB培養基平板上，37℃恒溫培養24 h，取單個菌落接種于液體培養基中靜置培養18 h作為計數的菌種。將上述培養的菌液用生理鹽水按101、102、103、104倍數進行稀釋，用無菌培養皿分別裝1 ml上述濃度菌液，在培養皿中加入9 ml無菌固體培養基混勻，置于37℃恒溫箱中培養24 h，進行細胞計數，以菌落數接近于100為準，計算每毫升的菌落數。

1.3尿道感染模型建立及分組 隨機選取10只大鼠用作空白對照(對照組)，40只用于建立尿道感染模型，模型建立參照參考文獻〔6〕：SD大鼠禁水過夜后以水合氯醛深度麻醉，在生物安全柜內用酒精消毒尿道口，使用硬膜外導管經尿道進入約3 cm到達膀胱，排空膀胱內殘留尿液，將配好的不同梯次的UPCE菌液注入膀胱，其中菌量分別為101CFU(101CFU組)、102CFU(102CFU組)、103CFU(103CFU組)和104CFU(104CFU組)，注入后用回形針夾住尿道口2～3 h后松開尿道。感染5 d后，測定各組大鼠的相關指標。

1.4觀察指標

1.4.1大鼠尿道上皮組織與尿液細菌定量 取大鼠感染5 d后尿液，用直接稀釋涂板定量方法來測定大鼠尿液細菌含量。在無菌操作環境中取大鼠中斷尿道上皮組織1 g，加入1 ml生理鹽水置入研磨器中，研磨成漿后用101、102、103、104倍數生理鹽水進行稀釋，分別取上述經不同倍數生理鹽水稀釋后的菌液各1 ml放入無菌平皿中，向各平皿中加入冷卻至45℃的無菌培養基9 ml，使培養基與菌液混勻，待凝固后，置于37℃恒溫箱中培養24 h，計算細菌菌落數。

1.4.2qRT-PCR 檢測大鼠尿道上皮組織CNF1、CD36 mRNA相對表達量 在無菌操作環境中，取1 g大鼠中段尿道上皮組織用研磨器研磨成勻漿，再用裂解液裂解組織，采用 Trizol 法提取組織總 RNA，將 mRNA 逆轉錄為cDNA，設置反應條件如下：37℃ 15 min(反轉錄反應)，85℃ 5 s(反轉錄酶的失活反應)，4℃ 15 min(穩定)。qRT-PCR 檢測CNF1、CD36 mRNA相對表達量。PCR程序如下：95℃預變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共 40 個循環，結果以 2-ΔΔCt法表示。CNF1、CD36及內參GAPDH的引物序列如下：CNF1上 游引物5′-AGCGACGTGGCTATTGTGAAG-3′，下 游引物5′-GCCATCATTCTTGAGGAGGAAGT-3；CD36上游引物5′-ATGAGACTGGGACCATCGGC-3′，下 游引物5′-CAACAAACATCACTACTCCAACACC-3′；GAPDH上游引物5′-CCTTCCGTGTTCCTACCCC-3′，下 游引物5′-GCCCAGGATGCCCTTTAGTG-3′。

1.4.3Western印跡檢測大鼠尿道上皮組織CNF1、CD36蛋白相對表達量 在無菌操作環境中，取1 g大鼠中段尿道上皮組織用研磨器研磨成勻漿，再用裂解液裂解組織，提取組織總蛋白，使用 BCA 蛋白定量試劑盒對提取的總蛋白進行定量，按比例加入 4×蛋白上樣緩沖液，95℃變性5 min，置于-20℃冰箱保存備用。設置濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為100 V進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉印。取聚偏氟乙烯(PVDF)膜用TBST洗膜5 min，共 3 次，加入到 2%牛血清白蛋白(BSA)(TBS 配制)封閉液中進行封閉，室溫搖床孵育 2 h。洗膜后先后加入一抗工作液和二抗工作液進行一抗孵育和二抗孵育。將新鮮配制的電化學發光(ECL)液滴加到 PVDF膜表面，轉移至成像分析系統暗箱中曝光，采集圖像并分析。蛋白定量：以相對光密度值代表蛋白表達量，以 GAPDH 為內參進行分析，實驗至少重復3次。利用 Western印跡檢測CNF1、CD36蛋白相對表達水平。

1.5統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、LSD檢驗、Pearson分析。

2 結 果

2.1不同菌量感染對大鼠尿道上皮組織與尿液菌量的影響 各組尿道上皮組織和尿液菌量均有明顯差異(均P<0.05)，且尿道上皮組織和尿液菌量在101CFU組、102CFU組、103CFU組、104CFU組中依次升高，兩兩比較均有統計學差異(P<0.05)。見表1。

表1 不同菌量感染對大鼠尿道上皮組織與尿液菌量的影響

2.2不同菌量感染對大鼠尿道上皮組織CNF1 mRNA和CD36 mRNA表達水平的影響 對照組、101CFU組、102CFU組、103CFU組和104CFU組中，CNF1 mRNA蛋白表達水平依次升高，CD36 mRNA蛋白表達水平依次降低，兩兩比較均有統計學差異(P<0.05)。見表2。

表2 不同菌量感染對大鼠尿道上皮組織CNF1 mRNA和CD36 mRNA表達水平的影響

2.3不同菌量感染對大鼠尿道上皮組織CNF1和CD36蛋白表達水平的影響 對照組、101CFU組、102CFU組、103CFU組和104CFU組中，CNF1蛋白表達水平依次升高，CD36蛋白表達水平依次降低，兩兩比較均有統計學差異(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 Western印跡檢測CNF1、CD36蛋白表達

表3 不同菌量感染對大鼠尿道上皮組織CNF1和CD36蛋白表達水平的影響

2.4大鼠尿道上皮組織和尿液菌量與CNF1和CD36蛋白表達相關性 尿道上皮組織菌量與CNF1蛋白及其mRNA呈正相關(r=0.861，0.835；P=0.000)；尿道上皮組織菌量與CD36蛋白及其mRNA呈負相關(r=-0.808，-0.887；P=0.000)；尿液菌量與CNF1蛋白及其mRNA呈正相關(r=0.854，0.842；P=0.000)；尿道上皮組織菌量與CD36蛋白及其mRNA呈負相關(r=-0.825，-0.885；P=0.000)。結果提示尿道上皮組織和尿液菌量與CNF1表達呈正相關，與CD36表達呈負相關。

3 討 論

大腸埃希菌ATCC 25922菌株是臨床尿路感染患者體內分離株，具有較高的致病能力，此外大腸埃希菌ATCC菌株毒力特點和基因組的相關基礎研究豐富〔7～9〕，代表性較強，因此本實驗使用其作為尿路模型感染的病原體。在實驗建模過程中，為減少手術創傷及其他病原體感染腹腔影響本次實驗結果，在嚴格無菌的環境采用無創方法，用導管插入尿道直接膀胱灌注培養的菌液，很大程度上減少組織炎癥反應，而且操作簡單。毛鑫等〔6〕研究認為建模3 d后大鼠尿路感染模型的感染程度最高，而預實驗中利用同樣的方法建模時顯示尿路含菌量在感染5 d后達到高峰，結果差異可能是由于選用的動物品種、動物年齡及大腸埃希菌菌株不同造成的。建模5 d后，建模各組的大鼠尿道上皮組織及尿液均檢測到UPEC，結果提示兩者菌量高低與UPEC感染量相關。

許多病原菌對宿主三磷酸鳥苷(GTP)結合蛋白產生毒力因子，特別是Rho家族的小GTPas1和GTPas2。在活性GTP結合構象和非活性二磷酸鳥苷(GDP)結合構象之間的轉換中，Rho家族小分子鳥苷三磷酸酶(Rho-GTPase)對調節肌動蛋白細胞骨架和其他細胞功能具有重要的作用，如細胞周期、極性、遷移、胞質分裂、增殖、凋亡和存活〔10〕。病原菌通過激活或抑制Rho-GTPase的功能，破壞宿主上皮屏障〔11〕。CNF1是UPEC產生的一種毒素蛋白，其可通過誘導谷氨酰胺去酰胺作用激活宿主真核細胞中Rho家族的小GTPase，從而干擾多種細胞功能〔12〕。此外還有研究顯示CNF1通過受體介導的內吞作用與上皮細胞表面結合后被內化，CNF1在干擾宿主細胞周期中起著重要作用〔13〕。在高血壓性視網膜病變大鼠模型中，抑制CNF1產生可減輕視網膜膠質增生并改善視覺表現〔14〕。有報道指出抗溶血素和CNF1的抗體可減輕產毒性尿致病性大腸桿菌尿路感染小鼠的膀胱炎癥〔15〕；大腸桿菌α-溶血素可對抗Rho-GTPase激活毒素CNF1在菌血癥期間引發的抗毒性天然免疫反應〔16〕。基于以上研究可知，CNF1激活Rho-GTPase的功能，從而破壞宿主上皮屏障引起尿路感染。本實驗結果符合高菌量產生高毒素蛋白的理論，結果證實了UPEC感染量可直接影響CNF1的表達。CD36是一種重要的清道夫受體，負責清除病原菌和凋亡細胞，在宿主免疫防御和體內平衡中發揮重要作用〔17〕。研究顯示，炎癥與CD36作用高度相關，CD36可在炎癥反應誘導下加重腎臟損傷作〔18,19〕，CD36表達異常易造成尿路感染〔4,20〕。實驗結果體現出了CNF1下調CD36表達的結果〔4,20〕。

綜上所述，感染大鼠尿路菌量越高，其尿道上皮組織菌量、尿液菌量和CNF1表達越高，CD36表達越低，尿道感染可能與高菌量影響CNF1和CD36表達相關。