CLU的基因多態性與非癡呆型血管認知障礙的相關性

蔣子賀 尹昌浩 朱曉峰,3

(1牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157000;2牡丹江醫學院附屬紅旗醫院;3黑龍江省缺血性腦卒中防治重點實驗室)

血管性認知障礙(VCI)是腦血管病變及其危險因素導致的臨床腦卒中或亞臨床血管性腦損傷，涉及至少一個認知域受損的臨床綜合征，涵蓋了從輕度認知障礙到癡呆，也包括合并阿爾茨海默病(AD)等混合性病理所致的不同程度的認知障礙。根據流行病學研究〔1〕，我國65歲以上的人群中VCI患病率約為8.7%。非癡呆型血管性認知障礙(VCIND)為血管性癡呆的早期階段，具有很高的危險性轉化為癡呆。對VCIND患者隨訪2年發現其演變為癡呆的比例高達40%〔2〕。研究〔3〕同樣顯示50%的VCIND患者有可能轉化為癡呆。VCIND臨床上主要表現以注意力、執行功能的減退及運動操作和信息處理速度的減慢為主，其可能與額葉-皮質下環路的阻斷有關。鑒于VCI一旦進入中晚期沒有治療藥物和手段，因此在早期階段的VCIND是VCI治療和預防的最佳階段。故明確其遺傳易感性及危險因素對于早期預防血管性癡呆具有重要的臨床意義。正目的簇集素(CLU)基因編碼clusterin，也稱為載脂蛋白J，是中樞神經系統中表達最豐富的載脂蛋白之一，可影響Aβ聚集、介導Aβ清除、調節脂質代謝、誘發補體反應及神經炎癥反應。CLU作為高密度脂蛋白膽固醇的組成部分，參與膽固醇的轉運，與動脈粥樣硬化(AS)〔4〕有關。而AS是VCI的最重要病因機制，基于以上，我們推測CLU基因可能參與VCI的發生和發展。本研究采用病例對照方法探討基因位點的多態性與VCIND的相關性，明確其在VCI病程進展中可能的作用機制，為VCI的早期預警生物學標志物及干預提供重要的臨床依據。

1 資料與方法

1.1受試者收集 2018年10月至2019年10月牡丹江醫學院紅旗醫院招募右利手VCIND患者42例納入VCIND組，認知正常者23例納入認知正常組。入組標準(參照“2016中國血管性認知障礙診療指導規范”中VCIND的診斷標準〔5〕)：①病史：患者知情者有記憶力下降的主訴；②認知：至少1項認知領域存在損害證據；③功能：工具性日常生活活功能力量表(IADL)正常或輕微受損，不足以影響獨立性；④血管病證據：臨床腦卒中史或影像學證實的腦血管病灶；⑤支持血管性原因的特征：腦血管病是認知損害的主要原因。排除標準：其他可引起認知功能障礙的疾病，例如可引起認知功能障礙的神經系統其他疾病(如腦腫瘤、帕金森病、腦炎、癲癇等)、腦外傷導致的認知障礙；其他可引起認知損害的疾病，如甲狀腺功能異常、嚴重貧血、梅毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、藥物、酒精等；有精神病史者或先天精神發育遲緩者；排除有嚴重聽、視力障礙，不能配合完成檢查者。

1.2神經心理學評估 簡易智力狀況檢查表(MMSE)中文版采用張明園修訂版，蒙特利爾認知評估(MoCA)中文版采用北京版：評分≤13分(文盲)，14～19分(小學)，20～24分(初中及以上)；MMSE評分≤19分(文盲)，20～22分(小學)，23～26分(初中及以上)。

1.3影像學評估 使用荷蘭飛利浦公司3.0T TX磁共振儀進行影像學檢查。所有受試者接受T1、T2、彌散加權成像、液體衰減反轉恢復序列及磁敏感加權成像，以識別各種標志性影像學改變。采用總SVD評分項目〔6〕包括：腔隙性數量≥1個，CMBs數量≥1個，EPVS，WMH腦室周圍 Fazekas評分≥3分或深部，上述項目各計1分，各項相加為總SVD評分。

1.4DNA提取方法及檢測 DNA提取收集空腹靜脈血5 ml并置于-80℃冰箱中，分批進行DNA的提取，質控合格。研究中SNP基因庫信息來自公共數據庫NCBI GeneBank數據庫，查詢基因CLU標準序列。其序列號為rs11136000及rs9331888位點。采用Primer Premier 3.0軟件設計SNPrs11136000及rs9331888位點的KASP引物rsl1136000snp位點Primer Allele FAM引物序列為5′-CCCTGAATCTTACCTTTCTATTGC-3′，Primer Allele HEX引物序列為5′-AAACTCCTGACCCCAAGTAATATG-3′，rs9331 888snp位點Primer_Allele FAM引物序列為5′-CAATTCCCTTCGGAGAGTAGAG-3′，Primer_Allele HEX引物序列為5′-GAAAGGGTCCATTGTGTAAGAC-3′。通過翼和應用生物技術有限公司得出PCR產物，樣本純化后高通量測序，測序得到的原始二進制basecalling數據經Illumina bcl2fastq軟件轉化為序列數據，Illumina RTA軟件進行圖像識別和Basecalling，Illumina bcl2fastq 2.17根據每個樣本的索引信息進行拆分混合測序(demultiplexing)并統計產出reads數和堿基測序質量(Q30)。

1.5統計分析 使用SPSS21.0進行χ2檢驗、獨立樣本t檢驗評估人口統計學變量的分類。進行Hardy Weinberg平衡定律吻合度測定，采用χ2檢驗、隨機區組設計資料的多因素方差分析進行比較。

2 結 果

2.1人口學資料及血管性危險因素的比較 兩組在年齡、性別、民族、吸煙、飲酒史、糖尿病、心臟病、同型半胱氨酸水平、血脂水平方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)；兩組在高血壓方面比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 人口學資料及血管性危險因素分析

2.2基因型和等位基因頻率分布 電泳結果提示，CLU基因認識rs11136000snp位點共3種基因型：TT型、TC型、CC型(表2)。兩組TT基因型和T等位基因頻率分布相比，VCIND組明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。且CLU基因rs11136000位點C基因攜帶者(CC+CT)罹患VCIND的風險是非C基因攜帶者(TT)的6.875倍(95%CI為0.820～57.626，P<0.05)。rs9331888snp位點共3種基因型：GG型、GC型、CC型(表3)，兩組基因型與等位基因對比，無顯著差異(P>0.05)。

表2 rs11136000與VCIND的關系〔n(%)〕

表3 rs9331888與VCIND的關系〔n(%)〕

2.3VCIND與SVD評分的相關性 VCIND組影像學評分〔(2.12±0.80)分〕明顯高于認知正常組〔(1.04±0.825)分〕，差異有統計學意義(P<0.001)，提示在VCIND患者中多表現為腔隙性腦梗死、顱內微出血、血管間隙、腦白質改變等顱內結構性變化。在SVD評分亞組中，腔隙性腦梗死、血管間隙、腦白質比較，差異有統計學意義(P<0.05，表4)，提示有腔隙性腦梗死、血管間隙、腦白質改變的患者更容易產生認知障礙。

表4 VCIND與影像學分型之間的關系〔n(%)〕

2.4CLU基因snp位點與VCIND影像學交互作用 rs11136000snp位點兩組SVD評分存在顯著性差異(P<0.001)，提示CLU基因rs11136000位點與VCIND影像學存在交互作用(表5)；攜帶rs11136000snp位點的兩組比較，在腔隙性腦梗死、腦白質高信號中，存在顯著差異(P<0.05)，見表6。rs9331888snp位點兩組SVD總分對比，存在顯著差異(P<0.001)，提示CLU基因 rs9331888位點與VCIND影像學存在交互作用(表7)；攜帶9331888snp位點的兩組比較，在腦白質高信號、血管間隙擴大中存在顯著差異(P<0.05)，見表8。

表5 rs11136000snp位點VCIND患者與影像學的交互作用

表6 rs11136000snp位點VCIND患者與影像學亞型的交互作用

表7 rs9331888snp位點VCIND患者與影像學的交互作用

表8 rs9331888snp位點VCIND患者與影像學亞型的交互作用

3 討 論

VCI是指導致任何程度的認知損害的各種血管性腦部病變，范圍從主觀認知能力下降到癡呆。典型的VCI患者經常出現心理遲緩和執行功能等問題，包括高級認知功能，如記憶力問題、行為癥狀和心理癥狀。癡呆影響著全世界4 750萬人，這個數字預計每20年翻一番。癡呆人群給全世界的醫療保健系統帶來了巨大的壓力〔7〕。因此，及早對VCIND進行干預至關重要。對于VCIND，目前還沒有明確的遺傳危險因素，如果能夠尋找簡單的遺傳和生物誘發因素將會預測VCI疾病的發生并及早干預，將會大大降低血管性癡呆的發生率。

VCI的大多數危險因素是可以改變的，因此，針對這些危險因素可能會降低VCI的發生率。根據大型數據集和計算機模型的分析，導致血管性癡呆的7個最常見的可干預的危險因素：肥胖、高血壓、糖尿病、高膽固醇、吸煙、低教育水平和心血管疾病，消除這些危險因素估計將減少癡呆病例的三分之一〔8，9〕。高血壓促進認知功能下降的機制可能是多方面的，有強有力的證據表明瞬時改變血流影響血管運動能力的功能變化，高血壓還會促進微血管稀疏、內皮功能障礙、血腦屏障破壞、神經血管耦合減少、神經炎癥反應等，從而導致腦部缺氧引起神經功能障礙〔10〕。一項前瞻性、以社區為基礎的檀香山亞洲老齡化研究發現中年期血壓升高而未降壓治療者血管癡呆的風險增加〔11〕。Tzourio等〔12〕通過4年的隨訪發現有高血壓史的老年人認知功能下降的比例是無高血壓史的2.8倍。同型半胱氨酸轉化成的半胱氨酸減少，則谷胱甘肽水平下降，導致活性氧增加、氧化應激，從而導致腦部缺氧。既往研究〔13〕證實同型半胱氨酸水平的升高與執行功能障礙表現的降低之間呈正相關。以上結果均支持我們的研究。然而在本次研究中不具有統計學意義的危險因素考慮可能受本次樣本量影響。

本研究在VCIND組與認知正常組的比較中發現CLU基因的rs11136000snp位點攜帶者更容易出現認知障礙。考慮CLU基因多態性從以下方面影響血管性認知障礙的發展。①CLU基因多態性的表達可使顱內Aβ的沉積增加，破壞血腦屏障，造成大腦功能障礙和損害。CLU編碼的糖蛋白在淀粉樣蛋白斑中沉積，結合可溶性Aβ肽，與Aβ相互作用影響其構象和毒性，也參與血腦屏障Aβ的清除〔14〕。一項小鼠模型證明沒有CLU的情況下，Aβ的清除轉移到更多的血管周圍引流〔15〕。相關研究〔16〕提示CLU聚集素不僅存在于斑塊，而且還存在于大腦內的小動脈和毛細血管。Kim等〔17〕研究表明：大約30%的皮質下VCI，其特征是廣泛的腦小血管疾病，在正電子發射斷層掃描上有顯著的Aβ負荷。Huang等〔18〕研究招募了5例因一側頸動脈狹窄而患有癡呆的患者，他們接受了18F-AV1451PET的檢查，結果顯示癡呆和單側頸動脈狹窄的患者與正常對照組相比，整體淀粉樣蛋白沉積明顯增加。Ye等〔19〕研究結果表明淀粉樣蛋白負荷導致了小血管疾病患者的認知能力下降。一項相關研究〔20〕結果顯示腦卒中患者血漿Aβ、Aβ42和tau水平雖低于AD患者，但均高于認知正常組，最重要的是，有癡呆的腦卒中患者的Aβ42血漿水平明顯高于非癡呆患者。一項對72例腦卒中后認知受損患者的研究與隨訪發現〔21〕，有Aβ沉積的病人在腦卒中后3年內認知功能下降顯著。動物研究〔22〕表明，急性缺血增加了缺血損傷后不久Aβ前體蛋白的表達和Aβ的產生，從而增強了Aβ在腦中的沉積和清除。故CLU基因的多態性可能與VCI的發病有關。本研究得出的數據如預期的證實了這一觀點。②CLU基因多態性可能通過血脂代謝途徑影響VCI。血管內膜脂質集聚，腦血管內皮功能減弱，損害大腦的新陳代謝，繼而出現認知功能障礙。Anna等〔23〕發現在致密高密度脂蛋白顆粒的子集中存在CLU表達的蛋白，它可以抑制脂質過氧化或降解生物活性的低密度脂蛋白膽固醇氧化。既往研究表明血脂可增加血管內皮功能的損傷和血流動力學的改變，容易造成腦卒中及認知障礙的發生〔24〕。在曼哈頓北部腦卒中研究〔25〕以人群為基礎的病例對照研究中，高密度脂蛋白膽固醇水平的升高與老年人及不同種族和民族之間腦卒中風險的降低有關，增加了與腦卒中相關的脂質證據；在一項關于頸動脈斑塊形態相關危險因素的基于人群的橫斷面的病例對照研究中〔26〕，發現有回聲斑塊的受試者未來發生缺血性腦血管事件的風險更高。在動物研究中也觀察到，喂食富含飽和脂肪和膽固醇飲食的大鼠，血腦屏障通透性增加，伴隨著認知障礙〔27〕。結合上述結果，CLU基因多態性可能通過加劇脂質沉積造成血管性認知功能障礙。

血管疾病是VCI中最常見的損害；小血管疾病以動脈硬化和腔隙性梗死為特征，可引起皮質和皮質下微梗死，并對白質造成彌漫性缺血性損害〔28〕。Jokinen等〔29〕在3年的隨訪中發現：在MRI測量的多變量模型中，總的WMH、腔隙仍然是認知功能的獨立預測因子。上述結論與本研究的結果相同。其機制可能是阻斷了腦內傳導通路從而導致認知功能障礙。額葉與運動性活動和判斷、記憶、抽象思維、情緒、心境等精神活動有關；顳葉與行為、精神、記憶有關；內囊前肢、膝部參與投射到額葉或顳葉的路徑；丘腦受損后易產生記憶、言語、定向障礙，故上述部位的腔隙性腦梗死也會引起明顯的認知功能障礙。腦白質聯系著聯合纖維、聯絡纖維、投射纖維，腦白質的損傷可導致各個腦區的信息傳遞中斷，同時也會導致廣泛的膽堿能系統受損，從而導致認知障礙。Chua等〔30〕證明VCIND患者有更廣泛的腦白質改變。Wright等〔31〕大樣本研究發現腦白質病變范圍大小與認知功能損害存在明顯正相關性，當白質損害累計體積大于0.75%整顱腦體積時，認知和感覺運動能力將受損明顯。Huijts等〔32〕對189例VCI患者研究發現，基底節區血管周圍間隙(EPVS)的嚴重程度與認知障礙程度存在相關性。但是有學者發現EPVS并不是認知能力下降的預測指標，Benjamin等〔33〕研究得出在5年的隨訪期內EPVS與認知功能下降無關。這點與本研究結果不同，可能存在EPVS與Lacunes難以區分，或者被腦白質高信號(WMH)掩蓋。

本研究結果證實了CLU基因多態性通過使顱內Aβ的沉積增加，影響血脂代謝途徑，導致認知功能障礙。CLU基因多態性的VCIND可能更多表現出腦白質高信號。深部白質是一個分水嶺區域，容易受到血流量和氧氣供應減少的影響。脂代謝異常可加重其缺血。Aβ的沉積可導致血腦屏障破壞，從而導致脫髓鞘改變，最終形成WMH，導致VCI〔34〕。故CLU基因多態性通過使顱內Aβ的沉積增加，破壞血腦屏障，或脂代謝異常，造成WMH從而導致大腦功能障礙和損害的可能性大。上述結果仍需擴大樣本量進一步證實。另外，CLU基因最初被認為與AD有關的認知障礙密切相關，對于其與VCI的研究較少，可加強縱向隨訪、增加相關研究。