分子標記輔助選育攜帶抗稻瘟病基因Pigm的光溫敏不育系

李友發，張馨月，錢秋，劉江寧，富昊偉，汪慶*

(1.嘉興市農業科學研究院，浙江 嘉興 314016；2.無錫市哈勃生物種業技術研究院有限公司，江蘇 無錫 214000)

水稻是世界主要糧食作物之一，為全球一半以上的人口提供食物。然而，水稻在生產過程中，時常面臨各種病害的侵襲。其中，由稻瘟病病原菌(MagnaporthegriseaSacc)引起的稻瘟病是一種在全世界范圍內最具毀滅性的水稻真菌性病害[1]。在稻瘟病流行年份，一般可造成水稻減產10%～20%，嚴重的甚至達到40%～50%[2]。生產上抗稻瘟病主要是采用化學防治和抗病育種2種方式，但由于化學防治成本高，且隨著人們對綠色食品的不斷追求，培育和推廣抗病品種已成為控制該病害最為經濟有效的方法[3]。

雜交水稻由于雜種優勢強、產量高，得到政府的大力推廣。雜交水稻的稻瘟病抗性取決于其雙親的稻瘟病抗性[4]，選育抗稻瘟病的光溫敏核不育系是配組選育抗稻瘟病兩系雜交水稻新品種的重要途徑。傳統抗病育種育種周期長、易受外界條件的影響、育種效率低。相比之下，分子標記輔助選擇(MAS)育種可通過利用與目標基因緊密連鎖的分子標記對每個世代的單株進行高效、可靠的目標性狀的選擇，進而可以大幅提高育種的效率。

迄今為止，國內外已有100個稻瘟病抗性基因或QTLs被報道，它們分布在水稻的所有12條染色體上的不同位點，其中25個R基因已被成功克隆[5-6]。在已克隆的R基因中，Pigm基因是從持久抗稻瘟病品種谷梅4號中鑒定到的一個廣譜抗稻瘟病基因(簇)，具有廣譜抗性。本研究以高柱頭外露率、中粳類型溫敏不育系DS39、優質晚粳嘉58和攜帶Pigm的1350(揚州大學農學院提供)為材料，通過傳統雜交結合MAS和花藥培養技術，旨在獲得具有持久稻瘟病抗性且柱頭外露率高的晚粳類型兩系不育系，為選育安全高效的兩系雜交晚粳提供優良親本材料。

1 材料與方法

1.1 材料

選用無錫哈勃生物種業技術研究院有限公司選育的中粳類型不育系DS39、常規優質粳稻嘉58和攜帶Pigm基因的粳稻1350為實驗材料。

1.2 方法

1.2.1 材料種植

在水稻單核靠邊期取花苞，置于4 ℃環境中低溫預處理4～6 d，次氯酸鈉表面消毒后，于無菌操作臺中將6枚花藥挑出，接種于SK3誘導培養基中暗培養25 d左右，將愈傷組織轉移至MS培養基中分化培養20 d左右，即可分化出水稻幼苗。

1.2.2 基因型鑒定

材料選用需要篩選鑒定的株系的葉片，用CTAB法[7]提取DNA。

選用目標基因Pigm的功能標記M143104對各株系進行基因型篩選。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為F：5′-CCTTG TTCCTCCTGCTATC-3′，R：5′-ATCTCGCTGTTCAG TCTTG-3′。Pigm的擴增體系為：1 μL DNA模板、各1 μL 10 μmol·L-1正、反向引物、10 μL 2×EasyTaqSuper Mix、加無菌ddH2O補足20 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃延伸7 min。PCR擴增產物在2%質量體積比的瓊脂糖凝膠上電泳分離，分離結果用BIO-RAD凝膠成像系統觀察，進行拍照和記錄。

1.2.3 稻瘟病抗性鑒定

稻瘟病抗性鑒定在嘉興市農業科學研究院的水泥槽抗性鑒定圃進行。

試驗選用混合了來自于嘉興市農業科學研究院的15個致病力較強菌株的混合菌液進行水稻稻瘟病接種和抗性評價(表1)。菌株包括8個B型小種的菌株(04、005、07、803、901、916、921、934)和7個C型小種菌株(02、805、809、812、912、917、935)。5月10日播種，當幼苗達到三葉期時，采用噴霧法接種稻瘟病混合菌液，10 d后調查和記錄發病情況。

表1 稻瘟病的發病等級

1.2.4 農藝性狀考察

種植1 000株鑒定小區，在始穗期套袋自交100個，并隨機抽取50個稻穗的花粉鏡檢，考察該不育系育性，成熟期隨機選取15株光溫敏不育系JF35-2(不取邊行)。主要考察株高、分蘗數、單株穗數、穗長、每穗穎花數、柱頭外露率等性狀。

2 結果與分析

2.1 攜帶抗稻瘟病基因Pigm的兩系不育系材料的創制

所有試驗材料夏季和冬季分別種植在嘉興市農業科學研究院嘉興試驗基地和海南陵水試驗基地。2016年夏季，在嘉興以高柱頭外露率、中粳類型溫敏不育系DS39為母本，與優質晚粳嘉58雜交獲得F1代雜交種。2016年冬季，F1代雜交種種植于陵水，取稻苞進行花藥培養。2017年夏季，DH1種植于嘉興，篩選獲得26份不育系種子DH2。2017年冬季，DH2種植于陵水，編號為TS829-TS854，選擇白色大柱頭，雙外露，株型緊湊TS849繼續改良。2018年夏季TS849種植于嘉興，與攜帶Pigm粳稻材料1350雜交，獲得F1代雜交種。2018年冬季，F1代雜交種種植于陵水，取稻苞進行花藥培養。2019年夏季，把288份DH1種植于嘉興，通過分子標記選擇保留攜帶Pigm基因的單株108株，編號JF35-1到JF35-108，其中JF35-2表現最為突出(圖1)。

圖1 光溫敏不育系JF35-2的選育流程

2.2 基因型檢測

采用功能標記M143104對各雜交組合的后代以及花藥培養的單株及株系材料進行分子標記輔助選擇(圖2)，選擇出現亮色條帶(517 bp)的單株。最后通過分子標記選擇從288份材料中鑒定到108株攜帶Pigm基因的單株(JF35-1～JF35-108)。

圖2 抗稻瘟病基因Pigm的分子標記檢測

2.3 稻瘟病抗性鑒定

采用水泥槽病圃對各雜交組合的后代以及花藥培養的單株及株系苗期材料進行稻瘟病抗性鑒定。從表2中可以看出，攜帶Pigm基因的單株對稻瘟病的抗性均達到了抗或高抗水平。其中JF35-2對稻瘟病的抗性表現為高抗水平。

表2 部分株系對稻瘟病的抗性鑒定

2.4 農藝性狀考察

JF35-2屬粳型光溫敏兩系不育系，經田間調查，該不育系的農藝性狀整體良好。平均株高68 cm，株型適中，莖稈粗壯，葉色深綠，劍葉較短，分蘗力較強，平均單株有效穗11個、穗長16 cm、每穗穎花數170個，柱頭外露率47%，谷粒橢圓形，稃尖、柱頭無色。經1 000株群體考查，群體整齊一致，不育株率為100%；考察了100個套袋自交稻穗，自交結實率為0%；隨機抽取50個稻穗的花粉鏡檢，花粉敗育率99.96%，以典敗為主，典敗率99.95%。

3 討論

稻瘟病嚴重危害世界水稻生產[8]，且由于水稻新品種審定中對稻瘟病抗性差的品種實行“一票否決”制度[9]，因此，育種工作者在選育優良農藝性狀的同時還需要注意稻瘟病抗性的篩選。

傳統抗病品種的選育主要是通過親本選擇，多次雜交、回交、自交等育種過程，并根據實踐經驗進行田間表型的選擇來獲得。由于性狀與基因之間的數量對應關系復雜，加之表型又是基因型與環境相互作用的結果，因此，以表型來推測基因型存在著一定程度的不可靠性，導致表型選擇的效率較低，制約了品種抗病改良的進程。MAS育種可通過利用與抗病基因相關的分子標記來追蹤目標基因，這種分子水平上的間接選擇方法不受環境條件的限制和病原菌生理小種的影響，并且可在早代進行選擇，還能有效區分雜合體和純合體，從而在短時間內選育出純合型抗病的水稻材料[10]。此外，花藥培養可以快速純合育種材料，提高選擇效率，從而加快育種進程[11]，在水稻育種同樣具有重要的應用價值。

本研究采用分子標記輔助選擇和花藥培養技術相結合，打破了傳統育種的周期長、繁瑣等局限性，可準確快速獲得攜帶目標性狀的純合材料。本研究成功篩選到攜帶pigm基因的兩系不育系JF35-2，其農藝性狀良好，柱頭外露率高，且對稻瘟病的抗性也達到高抗水平，結果表明，分子標記輔助選擇和花藥培養技術在抗稻瘟病育種工作中的可能性，且含pigm的株系對稻瘟病的抗性極強，這與前人的研究結果一致[12]。