蔗糖濃度對白芨種子培養的影響

石麗敏，宋費玲，許巧賢，盧華兵，陶正明，姜武，吳志剛

(1.浙江省東陽玉米研究所，浙江 東陽 322100；2.浙江省亞熱帶植物研究所，浙江 溫州 325005)

白芨(BletillastriataReichb)是多年生草本地生蘭科白芨屬植物，也叫白及，別名冰球子、地螺絲、連及草等。主要分布在貴州、廣西、安徽、四川、云南、陜西和甘肅等地，多生長在海拔高度為950～3 500 m的疏生灌木和雜草山坡多石的闊葉林下，具有較強的適應性。白芨花色豐富，花型端莊而優雅、葉態美觀，具有極高的觀賞價值、藥用價值和經濟價值[1-3]。白芨自然繁殖力低，種子需與真菌共生才能萌發，加上長期采挖，使得野生白芨資源日漸枯竭，成為瀕危植物，被列為國家重點保護的野生藥材品種[4]。近年來，市場對白芨的需求量不斷上升，但由于野生資源有限，而用傳統的無性繁殖方式繁殖系數低，無法滿足大面積栽培需要，因此，利用組織培養技術繁育種苗成為當前人工栽培的主要種苗來源。在植物組織培養中, 蔗糖既可作為碳源物質促進細胞生長, 同時也可作為滲透壓調節物質維持細胞內外滲透壓的平衡[5]。糖的用量不僅影響著培養物的生長速度和生長量，還影響其代謝水平、次生代謝物的合成以及細胞的形態和發生，是影響植物組織培養成功與否的關鍵因素之一[6]。

我們在成功篩選出白芨種子培養相關培養基配方的基礎上，在培養基中添加不同濃度的蔗糖，考察蔗糖濃度對白芨種子培養中種子萌發分化以及生根壯苗過程的影響，以選擇適宜的蔗糖濃度，更好地進行白芨組培苗生產。

1 材料與方法

1.1 材料

供試白芨的成熟蒴果(種齡5個月以上)采于浙江省東陽玉米研究所塘西試驗基地。

1.2 方法

白芨成熟蒴果經過表面消毒處理后，剖開蒴果取出種子，接種到萌發分化培養基上，經過一段時間的誘導，種子萌發形成原球莖并分化成小苗，將分化形成的小苗轉移到生根壯苗培養基中培養。培養基均以MS培養基為基本培養基，添加7.0 g·L-1瓊脂，調節pH 5.8左右。

1.2.1 外植體的消毒

將白芨的蒴果先用自來水沖洗干凈，再置于洗潔精溶液中搖洗10 min，取出蒴果用自來水洗凈，瀝干水后，在超凈工作臺上先用75%的酒精消毒2 min；倒去酒精，再用0.1%的升汞消毒15 min；倒去升汞消毒液，用無菌水沖洗4～5次，瀝干備用。接種時，將經過表面消毒的蒴果放在無菌的不銹鋼盤上，切除頭尾約0.5 cm，然后將蒴果中段沿縱軸切開，取出種子，均勻地接種到培養基表面。

1.2.2 培養條件

培養室溫度為(25±2)℃，以日光燈為光源，光照強度為2 000～2 500 lx，每天照光12 h。

1.2.3 種子萌發分化

MS基本培養基添加一定濃度的激素為基本種子萌發分化培養基，設置添加0、1%、2%、3%、4%，5個濃度的蔗糖處理。將種子接種在萌發分化培養基中，每處理接種 5皿，接種后的培養皿移入培養室進行培養。45 d后統計種子萌發生長情況。

1.2.4 生根壯苗

MS培養基添加一定濃度的激素為基本生根壯苗培養基，設置添加1%、2%、3%、4%，4個濃度的蔗糖處理。將分化出的幼苗轉接到生根壯苗培養基中，每個處理接種10瓶，每瓶接種40株。90 d后調查統計幼苗生長及生根情況。

2 結果與分析

2.1 種子萌發分化

白芨接種7 d后，種子開始萌發變綠，20 d左右分化成小苗，45 d左右長成約0.4 cm高的無根幼苗，可進一步轉接到生根壯苗培養基上進行培養。

不同處理培養基上種子均能萌發和分化，且萌發率和分化率都高達99%(表1)；分化后，不同處理中幼苗生長發育情況有差異，其中不添加蔗糖處理的培養基上幼苗生長緩慢，相比其他處理幼苗更加矮小，其他幾個處理之間幼苗生長沒有明顯差異。表明前期種子萌發分化過程培養基中有無蔗糖對其沒有影響，但是分化成幼苗后，幼苗生長過程需要有蔗糖，蔗糖濃度對其影響不大，1%的濃度即可滿足幼苗生長需要。

表1 不同濃度蔗糖處理對白芨種子萌發分化的影響

2.2 生根壯苗

幼苗轉接進生根壯苗培養基后10 d左右開始生根，生根率為100%。約40 d后幼苗基部開始膨大，形成球莖。由表2可知，不同濃度蔗糖處理，幼苗都能生根，根的數量和長度與蔗糖濃度成正比，隨著蔗糖濃度的增加，根的數量不斷增多，根的長度也不斷增加。隨著蔗糖濃度提高，小苗生長速度也越加快，株高越來越高。

表2 不同濃度蔗糖對生根壯苗情況的影響

3 小結與討論

蔗糖是植物組織培養中不可或缺的重要物質，也是影響組培是否成功的關鍵因素之一。通過調查不同蔗糖濃度下白芨種子培養的生長發育情況，發現種子萌發成原球莖并分化成為幼苗的過程中，是否添加蔗糖、蔗糖的濃度都對其無顯著影響，說明白芨種子萌發分化過程不需要外源碳源，與St?ckel等[7-8]的蘭科藥用植物種子萌發完全依賴內生真菌提供必要的碳源、氮源等多種營養物質研究結果一致。在不添加蔗糖的培養基中幼苗生長緩慢，說明幼苗生長過程需要穩定的碳源，但是蔗糖濃度對幼苗生長影響不大，可能是因為幼苗在種子萌發分化培養基上培養時間短，從分化成幼苗到轉接只有25 d左右，1%的蔗糖濃度足以滿足生長需要。

小苗轉入壯苗生根培養基上后，培養基中的蔗糖濃度對其影響較大，隨著蔗糖濃度不斷增加，根的數量和長度也不斷增加，與王剛等[9]提出的蔗糖不僅作為碳水化合物提供營養, 而且像激素一樣誘導根的形成和促進根的生長, 其培養效果均隨著蔗糖濃度的增加而提高的論述一致。試驗中隨著蔗糖濃度不斷增加，小苗生長速度也越快越整齊，株高也越高,說明蔗糖濃度在1%～4%，隨著濃度的增加，蔗糖對幼苗生長促進作用越明顯，與劉江娜等[10]報道一致。由于試驗中蔗糖濃度設置局限，未能對更高濃度蔗糖對生根壯苗的影響變化進行探究，但從滿足移栽要求和節約生產成本角度出發，3%～4%的蔗糖濃度已基本可滿足白芨組培苗生產需要。本試驗只是從蔗糖提供碳源的角度出發，分析了其對白芨種子培養生長發育的影響，今后可進一步進行蔗糖濃度對白芨種子培養中次生代謝物質產生等方面的影響研究。