超聲波技術輔助酶解法提取杜仲葉總黃酮工藝優化*

王柏強，項 靜，張 杰，劉 福

（1.川北醫學院附屬醫院藥劑科，四川 南充637000；2.川北醫學院藥學院，四川 南充637000）

杜仲葉為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥葉，其味甘、微辛，性溫，歸肝、腎經，有補肝腎、強筋骨、降血壓、安胎等功效［1］。其有效成分主要為綠原酸等苯丙素類，蘆丁等黃酮類，京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷等環烯醚萜類，松脂醇二葡萄糖苷等木脂素類［2］。黃酮類化合物在抗氧化、抑制脂質過氧化反應、預防動脈粥樣硬化及保護心腦血管、防癌、抗癌等方面效果良好［3］。黃酮類化合物是胞內物質，傳統的水提法或醇提法不能有效破壞其細胞壁，存在很大的傳質阻力，導致提取效果欠佳［4］。目前，超聲波技術和酶解技術的發展為高效提取天然活性物質提供了新方法［5］。酶解法可破壞細胞壁，使更多重要化學成分（如黃酮）溶出；超聲波的空化作用可加速植物細胞壁破裂及活性物質釋放，提高有效物質提取率。本研究中結合酶解技術和超聲波提取技術，通過單因素試驗及正交試驗優化提取工藝，提高了杜仲葉總黃酮的提取效果。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

760CRT型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；PHS-SB型pH計（成都瑞馳分析控制儀器有限公司）；SB-25-12DT型超聲波提取器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；HH-2型恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）；TP-114型電子分析天平（德國賽多利斯股份有限公司，精度為0.1 mg）。

1.2 試藥

杜仲葉，采自四川省廣元市，經川北醫學院李生茂副教授鑒定為正品，曬干備用。纖維素酶（10 000 U/g），果膠酶（30 000 U/g），均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為0080-200707，純度為95%）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量測定

對照品溶液制備：取干燥至恒重的蘆丁對照品25 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得（質量濃度為0.5 mg/mL）。

檢測波長確定［6］：取對照品溶液0.3 mL，置10 mL容量瓶中，精密量定，加入5%亞硝酸鈉0.5 mL，靜置6 min，加入10%硝酸鋁0.5 mL，混勻，靜置6 min，加入4%氫氧化鈉4 mL，60%乙醇定容，靜置15 min。同法制備空白溶液。用紫外-可見分光光度計于400～800 nm波長范圍內進行光譜掃描，掃描結果顯示，于510 nm波長處有最大吸收峰。因此，確定最大吸收波長為510 nm。

線性關系考察：精密吸取對照品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，分別置10 mL容量瓶中。用0 mL試管做空白對照，于510 nm波長處測定吸光度，以蘆丁質量濃度（C）為縱坐標、吸光度（A）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程C＝1.732A＋0.071，r2＝0.999 9（n＝7）。結果表明，對照品蘆丁質量濃度在0.25～1.50 mg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

樣品含量測定：精確吸取藥材初提液1 mL，置10 mL容量瓶中，操作同線性關系考察項下，重復測定3次，計算平均吸光度值。根據公式［總黃酮提取率（%）＝初提液中總黃酮質量/杜仲葉干粉質量×100%］計算總黃酮提取率。

2.2 統計學處理

采用SPSS17.0統計學軟件分析。組間比較行t檢驗，正交試驗數據采用正交設計助手Ⅱ進行分析和處理。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.3 單因素試驗

2.3.1 酶的種類及用量

分別稱取杜仲葉粉末5g，各12份，置12個錐形瓶中，均分成兩組（纖維素酶組和果膠酶組）。按料液比1∶20（g∶mL，下同）加入60%乙醇溶液，調節pH至5.0，分別加入纖維素酶0，10，20，30，40，50 mg，加入果膠酶0，10，20，30，40，50 mg。恒溫（50℃）下酶解60 min，每15 min攪拌1次，超聲處理（功率為600 W，頻率為40kHz）20 min，抽濾，得濾液，測定總黃酮含量，并計算提取率，平行操作3次。結果纖維素酶組總黃酮提取率分別為1.66%，2.41%，3.09%，3.19%，3.14%，3.09%；果膠酶組總黃酮提取率分別為1.58%，2.16%，2.82%，2.95%，3.01%，2.92%。兩組提取率差異顯著（P＜0.05）。當添加纖維素酶量超過30 mg時，總黃酮提取率逐漸下降。

2.3.2 料液比

分別稱取杜仲葉粉末5 g，各6份，置6個錐形瓶中，按料液比1∶5，1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50加入60%乙醇溶液，調pH至5.0，加入纖維素酶30 mg，攪拌，溶解后在恒溫水浴鍋（50℃）酶解60 min，每15 min攪拌1次，其余操作同2.3.1項下步驟。結果總黃酮提取率 分 別 為2.49%，2.93%，3.17%，3.48%，3.43%，3.22%。可見，隨著料液比的增加，總黃酮提取率逐漸增大，當料液比達到1∶30后再繼續增加料液比，提取效率增加不明顯。可能是料液比過大降低了酶和底物的濃度，減少了酶分子與底物分子的碰撞概率，使底物未得到充分酶解，導致總黃酮溶出差異不明顯［7］。

2.3.3 酶解pH

分別稱取杜仲葉粉末5 g，各6份，置6個錐形瓶中，按料液比1∶30加入60%乙醇溶液，分別調pH至3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，加入纖維素酶30 mg，攪拌溶解后在恒溫水浴鍋（50℃）酶解60 min，每15 min攪拌1次，其余操作同2.3.1項下步驟。結果總黃酮提取率分別為2.14%，3.26%，3.49%，3.37%，3.05%，2.73%。可見，pH 4.5時總黃酮提取率最大。

2.3.4 酶解溫度

分別稱取杜仲葉粉末5 g，各6份，置6個錐形瓶中，按料液比1∶30加入60%乙醇溶液，調pH至4.5，加入纖維素酶30 mg，攪拌，溶解后分別于恒溫水浴鍋35，40，45，50，55，60℃下酶解60 min，每15 min攪拌1次，其余操作同2.3.1項下步驟。結果總黃酮提取率分別為3.05%，3.42%，3.53%，3.46%，3.41%，3.22%。可見，合適的酶解溫度有利于總黃酮的溶出，溫度過低不能保證酶的活性，過高酶又易失活，故酶解溫度保持在40～50℃為宜。

2.3.5 酶解時間

分別稱取杜仲葉粉末5 g，各6份，置6個錐形瓶中，按料液比1∶30加入60%乙醇，調pH至4.5，加入纖維素酶30 mg，攪拌，溶解后分別于恒溫水浴鍋45℃條件下酶解30，60，90，120，150，180 min，每15 min攪拌1次，其余操作同2.3.1項下步驟。結果總黃酮提取率分別為2.81%，3.45%，3.60%，3.52%，3.24%，3.18%。可見，隨著酶解時間的增加，總黃酮提取率逐漸增大；酶解時間為90 min時，酶解反應基本完成，總黃酮提取率最大；在90 min后提取率降低。因此，選擇酶解時間為90 min。

2.3.6 乙醇體積分數

分別稱取杜仲葉粉末5 g，各6份，置6個錐形瓶中，按料液比1∶30分別加入30%，40%，50%，60%，70%，80%乙醇，調pH至4.5，加入纖維素酶30 mg，攪拌，溶解后于恒溫水浴鍋45℃條件下酶解90 min，每15 min攪拌1次，其余操作同2.3.1項下步驟。結果總黃酮提取率分別為2.43%，2.97%，3.36%，3.64%，3.56%，3.08%。可見，杜仲葉總黃酮提取率隨著乙醇體積分數的增大而增加，在60%以后增速減慢，同時雜質溶出也明顯增多。故選擇不同乙醇體積分數（50%～70%）作進一步考察。

2.3.7 其他因素

分別考察超聲提取溫度、超聲時間對杜仲葉總黃酮提取率的影響。結果適宜的超聲提取溫度為40～60℃，超聲時間為15～25 min。

2.4 正交試驗優化總黃酮提取工藝

綜合單因素試驗結果，選取對總黃酮提取影響較大的纖維素酶用量（A）、料液比（B）、酶解pH（C）、酶解溫度（D）、乙醇體積分數（E）、超聲溫度（F）、超聲時間（G）7個因素，每個因素3個水平（見表1）。以總黃酮提取率為考察指標，選用L18（37）正交試驗表（見表2）進行正交試驗。結果見表3。可見，各因素對杜仲葉總黃酮提取率的影響效果大小為料液比＞酶解溫度＞纖維素酶用量＞超聲時間＞乙醇體積分數＞酶解pH＞超聲溫度。其中，料液比、酶解溫度、纖維素酶用量、超聲時間影響顯著（P＜0.05）。根據直觀分析及方差分析結果確定最佳工藝組合為A2B2C3D2E2F2G3，即纖維素酶用量30 mg，料液比1∶30，酶解pH 5.0，酶解溫度45℃，乙醇體積分數60%，超聲溫度50℃，超聲時間25 min。

表1 因素水平表Tab.1 Levels of factors

表2 L18（37）正交試驗設計與結果Tab.2 Results of the L18（37）orthogonal test

2.5 驗證試驗

分別稱取杜仲葉粉末5 g，各5份，置5個錐形瓶中，按料液比1∶30加入60%乙醇，調pH至5.0，加入纖維素酶30 mg，攪拌，溶解后于恒溫水浴鍋45℃條件下酶解90min，每15min攪拌1次，超聲處理（溫度50℃，功率600W，頻率40 kHz）25 min，抽濾，得濾液，測定總黃酮含量。結果杜仲葉總黃酮平均提取率為3.80%，RSD為1.49%。

表3 方差分析結果Tab.3 Results of variance analysis

3 討論

天然產物的提取過程中，加入一定量的酶可破壞構成藥材細胞壁和細胞間質的果膠、纖維素、半纖維素等大分子化合物，使細胞內物質充分溶解，提高有效成分的溶出速率；降低提取溫度，可縮短提取時間；減少溶劑用量，可提高有效成分提取率［8-9］。本試驗中利用超聲波輔助酶解法提取杜仲葉中的總黃酮，在單因素試驗基礎上通過正交試驗優化杜仲葉總黃酮的提取工藝，得最佳工藝條件：纖維素酶用量30 mg，料液比1∶30，酶解pH 5.0，酶解溫度45℃，乙醇體積分數60%，超聲溫度50℃，超聲時間25 min。此工藝條件下杜仲葉總黃酮提取率為3.80%，與傳統回流提取法比較，條件溫和，溶劑用量較少，有效成分提取率高，節能、降耗，保護環境。