辛伐他汀對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠炎性因子表達(dá)的影響*

劉 青，孫伯堅，任冬飛，李 林，楊智暉，梁瑞凱

（1.河北省老年病醫(yī)院，河北 石家莊050021；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，河北 石家莊050000）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是臨床常見的以氣流受限為主要特征的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，且病情呈進(jìn)行性發(fā)展，發(fā)病率及致死率均較高［1-2］。目前，臨床認(rèn)為COPD發(fā)病基礎(chǔ)為氣道慢性炎癥，主要累及氣道和肺實質(zhì)，炎性細(xì)胞在氣道內(nèi)的浸潤會促進(jìn)氣道內(nèi)黏液分泌，加重炎性反應(yīng)，造成氣道惡性循環(huán)，故炎性細(xì)胞及其細(xì)胞因子在COPD發(fā)病過程中扮演重要角色［3-4］。炎性因子包括白細(xì)胞介素（IL）家族大部分成員、腫瘤壞死因子（TNF）家族成員及基質(zhì)金屬蛋白等，其中白細(xì)胞介素17（IL-17）、白細(xì)胞介素22（IL-22）均參與COPD發(fā)病過程，故有效阻斷IL-17，IL-22等炎性因子的釋放對于減輕炎性反應(yīng)尤為關(guān)鍵［5-6］。目前，臨床對COPD的治療多以減輕癥狀、預(yù)防感染、抑制病情繼續(xù)惡化為主，出現(xiàn)重度及極重度氣流受限癥狀的患者常使用糖皮質(zhì)激素類藥物，以減輕氣道炎性程度，但長期服用易出現(xiàn)藥品不良反應(yīng)，不利于康復(fù)［7-8］。近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物在COPD的預(yù)防及治療中具有廣闊前景，但具體抗炎機制及藥理作用尚不清楚［9］。本研究中觀察了辛伐他汀對COPD模型大鼠IL-17和IL-22表達(dá)的影響。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

1.1.1 儀器

CX32RTSF型顯微鏡（日本Olympus公司）；RM2235型石蠟切片機、EG1160型石蠟包埋機（德國Leica公司）；MLS-3750型全自動高壓蒸汽鍋（日本Sanyo公司）；BI-2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；LHP-400B型培養(yǎng)箱（江蘇省金壇市雙捷實驗儀器廠）。

1.1.2 試藥

辛伐他?。ū贝筢t(yī)藥股份有限公司，批號為20193359，規(guī)格為每片20 mg）；10%水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，批號為20141001）；脂多糖（LPS，美國Sigma公司，批號為L2880）；視黃酸相關(guān)孤兒受體γt（RORγt，上海研卉生物科技有限公司，批號為ab219496）；香煙（滁州煙卷廠，規(guī)格為每支含尼古丁1.2 mg、焦油19 mg）；其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.1.3 動物

清潔級SD大鼠50只，雄性，體質(zhì)量0.18～0.22 kg，周齡6～8周，購自河北醫(yī)科大學(xué)動物管理中心［實驗動物許可證號SCXK（冀）2013-1-003］。標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)7 d，自由進(jìn)食、飲水，適宜溫度、濕度，人工黑暗和光照交替。

1.2 方法

1.2.1 模型建立

分別于第29，43天以水合氯醛（0.5 mg/100 g）麻醉大鼠，然后向氣管內(nèi)注入LPS 200μg；每日上午將大鼠放于密封的1 m3煙室內(nèi)，持續(xù)放入香煙煙霧，確保大鼠持續(xù)吸煙30 min，每日1次，每次15支，復(fù)制模型共用時56 d。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠行動靈敏度及活動力均下降，進(jìn)食量減少，毛發(fā)逐漸失去光澤，出現(xiàn)干澀枯黃，對外界刺激的敏感度下降，體質(zhì)量明顯減輕；病理學(xué)改變，開胸可見肺臟萎陷，肺臟體積明顯增大，呈灰暗色；蘇木精-伊紅（HE）染色見典型肺氣腫表現(xiàn)。

1.2.2 分組與給藥

將50只大鼠隨機分為空白對照組（等體積生理鹽水）、模型組（等體積生理鹽水）和辛伐他汀高、中、低劑量組（15，10，5 mg/kg），灌胃給藥，每日1次，連續(xù)灌胃8周（除煙熏日外）。

1.2.3 免疫組化檢測

腹腔注射10%水合氯醛（0.5 mg/100 g）麻醉大鼠，開胸后心臟放血處死大鼠［10］。2葉右肺標(biāo)本離體后用10%甲醛溶液固定24 h，脫水、石蠟包埋、切片。以HE染色，置顯微鏡下、選取6個視野觀察，分析白細(xì)胞介素17（IL-17）、白細(xì)胞介素22（IL-22）及RORγt表達(dá)水平。細(xì)胞胞漿內(nèi)呈棕黃色顆粒即為陽性表達(dá)，顏色與表達(dá)呈正比，棕黃色顆粒越多即表達(dá)水平越強；細(xì)胞胞漿內(nèi)未出現(xiàn)棕黃色顆粒即為陰性。

1.2.4 炎性因子表達(dá)水平檢測

取上述切片，置顯微鏡下，以圖像分析軟件分析支氣管黏膜上皮細(xì)胞陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。選取內(nèi)徑＜2 mm的小氣道，統(tǒng)計出氣道間隔陽性細(xì)胞數(shù)，以每1 m3陽性細(xì)胞數(shù)表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對大鼠肺組織切片炎性因子表達(dá)的影響

結(jié)果見圖1（因篇幅所限，僅選取辛伐他汀高劑量組作為代表）。

2.2 對大鼠氣道間隔炎性因子陽性細(xì)胞數(shù)的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠氣道間隔IL-17，IL-22，RORγt陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀高、中劑量組大鼠氣道間隔IL-17，IL-22，RORγt陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）。詳見表1。

2.3 對大鼠支氣管黏膜上皮組織炎性因子陽性細(xì)胞數(shù)的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠支氣管黏膜上皮組織IL-17，IL-22，RORγt陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀高、中劑量組大鼠支氣管黏膜上皮組織IL-17，IL-22，RORγt陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）。詳見表2。

3 討論

COPD作為臨床常見病及多發(fā)病，發(fā)病機制較復(fù)雜，且目前臨床針對該疾病的基礎(chǔ)研究及防治均無關(guān)鍵性突破［11-12］。COPD動物模型應(yīng)具備慢性氣道阻塞、小氣道受阻增大及肺順應(yīng)性降低、與COPD相似的誘因、出現(xiàn)氣道重塑及氣道高反應(yīng)性等特征［13-14］。目前，臨床認(rèn)為齒類動物可作為建模的最佳動物，其基因測序與人類極為相似；且其價格低廉，繁殖周期較快［15］。本研究中實施吸煙加氣道內(nèi)注射內(nèi)毒素多因素誘導(dǎo)方案，香煙中含有甘油的尼古丁及氫氰酸等有毒物質(zhì)可破壞氣管纖毛上皮細(xì)胞，導(dǎo)致上皮細(xì)胞組織出現(xiàn)損傷或壞死，且氣道及肺組織在煙霧作用下，通透性增加，易被蛋白酶攻擊，損傷肺組織，最終誘發(fā)COPD［16-17］。

圖1 免疫組化圖（HE，×400）A.IL-17 B.IL-22 C.RORγtA1，B1，C1.Blank control group A2，B2，C2.Model group A3，B3，C3.Simvastatin high-dose groupFig.1 Immunohistochemical image（HE staining，×400）

表1 各組大鼠氣道間隔炎性因子陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s，%，n＝10）Tab.1 Comparison of the positive cells of inflammatory factors in airway septum of rats among the five groups（±s，%，n＝10）

表1 各組大鼠氣道間隔炎性因子陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s，%，n＝10）Tab.1 Comparison of the positive cells of inflammatory factors in airway septum of rats among the five groups（±s，%，n＝10）

注：與空白對照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05。表2同。Note：Compared with those in the blank control group，a P＜0.05；compared with those in the model group，bP＜0.05；as well as Tab.2.

組別空白對照組模型組辛伐他汀 低劑量組中劑量組高劑量組IL-17 5.34±3.25 95.34±15.34a 85.64±13.24 76.35±11.28b 65.84±8.64b IL-22 8.64±3.15 64.98±9.68a 58.61±7.16 52.61±6.34b 38.64±4.02b RORγt 6.82±4.34 77.68±12.34a 71.64±10.36 62.13±8.24b 54.36±6.87b

表2 各組大鼠支氣管黏膜上皮組織炎性因子陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s，%，n＝10）Tab.2 Comparison of the positive cells of inflammatory factors in the bronchial epithelial tissue of rats among the five groups（±s，%，n＝10）

表2 各組大鼠支氣管黏膜上皮組織炎性因子陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s，%，n＝10）Tab.2 Comparison of the positive cells of inflammatory factors in the bronchial epithelial tissue of rats among the five groups（±s，%，n＝10）

組別空白對照組模型組辛伐他汀 低劑量組中劑量組高劑量組IL-17 8.57±4.72 78.68±10.98a 70.15±8.34 65.34±6.25b 58.64±4.21b IL-22 6.28±5.04 58.97±9.35a 51.31±8.25 46.35±7.02b 38.64±4.25b RORγt 7.58±3.57 79.46±11.24a 71.54±10.64 65.34±9.15b 52.31±7.21b

IL-17主要來源于CD4＋T淋巴的Th17細(xì)胞，通過特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt編碼產(chǎn)生的效應(yīng)因子，促進(jìn)中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的聚集及基質(zhì)金屬蛋白酶-9的分泌［18-19］。此外，IL-17還可促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞中氣道黏液蛋白的產(chǎn)生，增強氣道炎性反應(yīng)，參與疾病發(fā)生與發(fā)展［20-22］。IL-22主要由Th17細(xì)胞及自然殺傷（NK）細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的分泌，加重氣道炎癥程度，加快COPD進(jìn)程［23］。他汀類藥物是3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，主要在肝臟內(nèi)合成，臨床常用于血管疾病并發(fā)癥預(yù)防及調(diào)脂治療［24］。相關(guān)研究表明，他汀類藥物可發(fā)揮抗炎、抗氧化及抑制黏附分子表達(dá)等作用［25］。本研究中，與模型組比較，辛伐他汀高、中劑量組大鼠氣道間隔和支氣管黏膜上皮組織IL-17，IL-22，RORγt陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少。辛伐他汀抑制氣道及肺組織中性粒細(xì)胞滲出及炎性因子的釋放，減輕全身炎性反應(yīng)，破壞炎性細(xì)胞包膜上抑制蛋白及脂筏結(jié)構(gòu)的異戊二烯化修飾，繼而起到抗炎作用。本研究仍有一定局限性，如未針對不同劑量辛伐他汀用于COPD模型大鼠的不良反應(yīng)進(jìn)行研究，今后需進(jìn)一步增加對不同劑量辛伐他汀治療COPD安全性問題的分析。

綜上所述，辛伐他汀可有效減弱COPD模型大鼠炎性因子的表達(dá)，減輕氣道及肺部炎性反應(yīng)。