滇產(chǎn)5種植物精油的抑菌性能及其成分分析

閆佳,牛延菲,史正軍,雷福厚,趙平,吳春華,*

(1. 西南林業(yè)大學(xué)化學(xué)與工程學(xué)院，昆明 650224；2. 廣西民族大學(xué)，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530006)

植物精油是植物次生代謝產(chǎn)物，是具有揮發(fā)性的一類油狀液體。其成分多達(dá)100余種，包括醇類、醛類、酚類、丙酮類、萜烯類和酸類等，可隨水蒸氣蒸出[1]。研究表明，多數(shù)天然源植物揮發(fā)油具有殺菌、防腐、防蟲等生物活性[2-3]。互葉白千層油可有效抑制灰霉病菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)[4-5],迷迭香油可作為殺菌劑有效抑制黃曲霉的活性[6],桉葉油對(duì)金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌等真菌抑制效果較好[7],丁香、肉桂精油能有效地抑制大米中青霉和黑曲霉的生長(zhǎng)[8]。由于植物精油具有廣譜抑菌活性、對(duì)人畜毒性小和不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，越來越多的植物精油受到人們的關(guān)注，可被廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、飼料和醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域。

食源性微生物不僅造成食物的腐敗變質(zhì)，甚至?xí)鹗澄镏卸荆{到我們的生命。其中，霉菌在生活中十分常見，霉菌毒素是霉菌次生代謝產(chǎn)物，廣泛分布在大米、小麥和深加工食品中[9]。當(dāng)被人體誤食或被皮膚吸收后，霉菌毒素常會(huì)引起機(jī)能減退、疾病乃至死亡。大多數(shù)產(chǎn)毒霉菌屬于青霉菌屬、曲霉菌屬、鐮孢霉菌[10]。

本研究以云南5種常見的植物資源為研究對(duì)象，用其揮發(fā)油針對(duì)主要食源性微生物進(jìn)行抑菌活性研究，并通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析其抑菌的主要活性成分，以期為云南豐富的植物資源利用和發(fā)展天然健康的食品抑菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

冬青(IlexchinensisSims)油、藍(lán)桉(EucalyptusglobulusLabill.)油、互葉白千層(Melaleucaalternifolia)油由云南森美達(dá)生物科技有限公司提供，均采用水蒸氣蒸餾提取。5年生迷迭香(Rosmarinusofficinalis)采自西南林業(yè)大學(xué)樹木園，3年生香葉天竺葵(Pelargoniumgraveolens)采自中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所種植大棚。

綠木霉(Trichodermaviride)、黑曲霉(Aspergillusniger)、桔青霉(Penicilliumcitrinum)均購自廣東省微生物菌種保藏中心。

水楊酸甲酯、二甲基亞砜、蔗糖和無水硫酸鈉均為分析純，瓊脂(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，馬鈴薯(市售)。

1.2 試驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，恒溫培養(yǎng)箱(寧波東南儀器有限公司)，高壓滅菌鍋(華粵行儀器有限公司)，冷藏箱(浙江華美電器制造有限公司)，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890A-5975C美國安捷倫公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植物精油的提取

選取供試植物葉片5 kg作為樣品，洗去泥灰，剪碎成碎片備用。將樣品置于水蒸氣蒸餾裝置中按常規(guī)水蒸氣蒸餾法提取3 h，靜置分層，取上層揮發(fā)油，加入無水硫酸鈉干燥，得到精油產(chǎn)品，密封避光冷藏保存。

1.3.2 5種植物精油抑菌活性的測(cè)定

供試菌懸液的制備參照王安可等[10]的方法略加改進(jìn)，將綠木霉、黑曲霉和桔青霉分別接種至直徑90 mm的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，暗培養(yǎng)(28 ℃)，7 d后用無菌環(huán)挑取培養(yǎng)基表面的菌體放入研缽中，加生理鹽水研磨至肉眼觀察無塊狀，然后經(jīng)無菌棉球過濾至三角瓶中，制備成菌懸液。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用無菌生理鹽水分別將3種菌的懸濁液稀釋至濃度為1×106個(gè)/mL，在4 ℃冷藏箱保存?zhèn)溆谩?/p>

抑菌活性的測(cè)定采用濾紙片法[11]，吸取3種菌懸液各200 μL移至PDA培養(yǎng)基上，用滅菌后的涂布棒涂布均勻，將培養(yǎng)基平均分為4個(gè)區(qū)間，每個(gè)區(qū)間分別放入直徑為6 mm的滅菌濾紙片，其中3個(gè)濾紙片上分別注入5 μL植物精油，空白對(duì)照則注入5 μL蒸餾水，然后將培養(yǎng)皿用保鮮膜包好倒置放入28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，3 d后開始用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑[12]， 3次平行試驗(yàn)。

1.3.3 5種植物精油的最小抑菌濃度測(cè)定

參考牛彪等[13]的方法并稍加改變，用二甲基亞砜(DMSO)助溶，按照精油與DMSO體積比為1∶9分別將5種植物精油溶解，用蒸餾水將溶解的精油稀釋成體積濃度為0.06，0.13，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00 μL/mL的溶液，與未凝固PDA培養(yǎng)基充分混勻后倒入培養(yǎng)皿中，待凝固后用移液槍吸取200 μL的菌懸液于培養(yǎng)基上，用三角棒涂布均勻，最后用保鮮膜包好放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2 d后觀察并記錄培養(yǎng)基的情況，從而得出5種植物精油抑制綠木霉、黑曲霉和桔青霉的最小抑菌濃度。

1.3.4 5種植物精油的成分分析

植物精油的成分分析使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，并參照董麗華等[14]的檢測(cè)方法。色譜柱為Agilent DB-17MS 毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，色譜條件：程序升溫(初始溫度為70 ℃保持10 min，以5 ℃/min升至150 ℃保持2 min，以 10 ℃/min升至220 ℃保持10 min)，載氣為高純氦氣，恒流模式，柱流量1 mL/min，平均線速度37 cm/s，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度230 ℃，分流比50∶1。質(zhì)譜條件：EI電離模式，電子倍增管電壓1 913.0 V，電子能量70.0 eV，離子傳輸管溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，掃描質(zhì)量范圍30～550 m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種植物精油對(duì)3種霉菌的抑菌活性

5種植物精油對(duì)綠木霉、黑曲霉和桔青霉的抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 5種植物精油對(duì)3種霉菌的抑菌活性Fig. 1 The antifungal activity of five plant essential oils against three molds

由圖1a可知，前4天5種植物精油對(duì)綠木霉的抑菌活性關(guān)系為：冬青油=香葉天竺葵油>互葉白千層油>迷迭香油>藍(lán)桉油，冬青油和香葉天竺葵油的抑菌活性保持不變，其他3種均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。從第5天開始冬青油和香葉天竺葵油的抑菌活性也呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，冬青油下降得更為劇烈，但抑菌活性明顯大于其他3種精油；藍(lán)桉油和迷迭香油的抑菌活性持續(xù)性較差，到第6天、第7天已無抑菌效果；互葉白千層油的抑菌效果中等，但其抑菌活性的持續(xù)性較好。

由圖1b可知，香葉天竺葵油對(duì)黑曲霉的抑菌效果最好，其次是冬青油，迷迭香油和互葉白千層油，藍(lán)桉油的最差，幾乎沒有抑菌效果。前4天香葉天竺葵油和冬青油對(duì)黑曲霉具有同等的抑菌效果，從第5天開始冬青油和香葉天竺葵油的抑菌活性急劇下降。互葉白千層油和迷迭香油的抑菌效果持續(xù)性較好。

由圖1c可知，5種植物精油對(duì)桔青霉有不同的抑菌作用，香葉天竺葵油和冬青油的抑菌效果最好，其次是互葉白千層油，迷迭香油和藍(lán)桉油的抑菌效果相當(dāng)，且持續(xù)性較好。

5種植物精油對(duì)綠木霉、黑曲霉和桔青霉3 d后的抑菌活性效果見圖2。

圖2 5種植物精油對(duì)3種霉菌3 d后的抑菌活性效果Fig. 2 Antifungal activity of five plant essential oils against three molds after 3 days

由圖2可知，冬青油和香葉天竺葵油對(duì)綠木霉、黑曲霉和桔青霉的抑菌效果較強(qiáng)，培養(yǎng)皿內(nèi)均無菌生長(zhǎng)，這是由于精油植物揮發(fā)到整個(gè)培養(yǎng)皿中。藍(lán)桉油對(duì)黑曲霉的抑菌圈直徑為0 mm，對(duì)綠木霉的抑菌效果也較弱。迷迭香油對(duì)3種霉菌的抑菌圈直徑較小，表明抑菌活性相對(duì)較弱。互葉白千層油的抑菌效果比冬青油和香葉天竺葵油差，但比迷迭香油和藍(lán)桉油好。

2.2 5種植物精油的最小抑菌濃度

為了進(jìn)一步確定冬青油、桉葉油、互葉白千層油、迷迭香油和香葉天竺葵油的抑菌效果，試驗(yàn)測(cè)定了5種植物精油的最小抑菌濃度(MIC)，結(jié)果見表1。冬青油、藍(lán)桉油、互葉白千層油、迷迭香油和香葉天竺葵油對(duì)綠木霉的最小抑菌濃度分別為0.25，4.00，2.00，4.00和0.13 μL/mL，對(duì)黑曲霉的最小抑菌濃度分別為0.13，8.00，2.00，4.00和0.50 μL/mL，對(duì)桔青霉的最小抑菌濃度分別為0.25，8.00，4.00，4.00，0.50 μL/mL。其中冬青油的抑菌優(yōu)勢(shì)突出，在濃度為0.13 μL/mL時(shí)可以完全抑制黑曲霉的生長(zhǎng)，對(duì)綠木霉和桔青霉的最小抑菌濃度均為0.25 μL/mL。香葉天竺葵油在濃度為0.13 μL/mL時(shí)可以完全抑制綠木霉的生長(zhǎng)。互葉百千層油對(duì)3種霉菌的抑菌區(qū)間為2～4 μL/mL，迷迭香油對(duì)3種霉菌的抑菌區(qū)間均為4 μL/mL，藍(lán)桉油的抑菌效果最差。

表1 5種植物精油對(duì)3種霉菌的最小抑菌濃度Table 1 Minimum inhibitory concentrations of five plant essential oils on three molds

2.3 5種植物精油的成分分析

利用GC-MS對(duì)精油成分進(jìn)行分析，得到5種植物精油總離子流圖，見圖3。總離子流圖中各成分經(jīng)質(zhì)譜工作站MSD ChemStation檢測(cè)，利用NIST08標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫對(duì)化合物質(zhì)譜進(jìn)行檢索對(duì)照，確定各種化學(xué)成分，并按色譜峰面積歸一化法計(jì)算各成分的相對(duì)百分含量。

a)冬青油；b)藍(lán)桉油；c)互葉白千層油；d)迷迭香油；e)香葉天竺葵油。圖3 5種植物精油的離子流圖Fig. 3 Total ion chromatograms of five plant essential oils

由圖3a可知，冬青油僅檢測(cè)出水楊酸甲酯1種成分。相關(guān)研究報(bào)道了水楊酸甲酯是通過破壞細(xì)胞的完整性使重要離子從真菌細(xì)胞膜滲漏，從而導(dǎo)致膜通透性紊亂，細(xì)胞死亡，在抑制食品霉變上有很好的效果[15]。本研究的結(jié)果也表明，冬青油能很好地抑制綠木霉、黑曲霉和桔青霉的生長(zhǎng)。

由圖3c可知，互葉白千層油分離出36種成分，其主要成分有4-萜烯醇(42.68%)、γ-松油烯(13.69%)、(+)-4-蒈烯(6.32%)、對(duì)傘花烴(5.94%)、α-松油醇(4.59%)、萜品油烯(2.56%)，其中碳?xì)浠衔锕?7種，占47.72%，醇類化合物共9種，占51.44%，酸類只有一種，占0.84%。其成分符合國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，即4-萜烯醇≥30%，1,8-桉葉素≤5%。Yu等[18]研究發(fā)現(xiàn)互葉白千層油中主要是4-萜烯醇通過破壞膜的完整性并增加滲透性，導(dǎo)致離子泄漏和膜功能障礙，其次起作用的成分為α-松油醇、萜品油烯，然后是1,8-桉葉素，還證明了4-萜烯醇可使細(xì)胞膜破裂，與1,8-桉葉素組合增加了細(xì)胞外的電導(dǎo)率，具有協(xié)同效應(yīng)。Terzi等[19]也證實(shí)互葉白千層油中4-萜烯醇和1,8-桉葉素對(duì)真菌有較強(qiáng)的抑制效果。Li等[20]發(fā)現(xiàn)γ-松油烯在互葉白千層油中也占有較大的成分，該成分有較好的抑菌活性，但效力低于4-萜烯醇。An等[21]證實(shí)了互葉白千層油在抑制黑曲霉中α-松油醇和4-萜烯醇具有較強(qiáng)的抑制作用。本試驗(yàn)也表明，互葉白千層油對(duì)3種霉菌有一定的抑菌效果，但不如冬青油和香葉天竺葵油效果好。可能是互葉白千層油抑制霉菌的活性成分主要是4-萜烯醇、α-松油醇、γ-松油烯，存在4-萜烯醇與1,8-桉葉素的協(xié)同效應(yīng)，其他活性成分對(duì)抑菌也有協(xié)同效應(yīng)，但成分較少，抑菌活性不明顯。

由圖3d可知，迷迭香精油分離出38種成分。含量較高的化合物有1,8-桉葉素(21.02%)、馬鞭草烯酮(16.89%)、3-蒈烯(15.14%)、香葉醇(5.72%)、龍腦(4.77%)、芳樟醇(3.25%)、檸檬烯(2.95%)。Prieto等[22]實(shí)驗(yàn)證明馬鞭草酮對(duì)赤霉病鏈霉菌有極好的抑制作用，同時(shí)也具有抗腫瘤抗蟲的廣譜抑菌性。Souza等[23]研究發(fā)現(xiàn)亞馬遜河的Aniba物種APEA含有40%的芳樟醇對(duì)黃曲霉、黑曲霉、鐮刀菌、黑穗病菌和炭疽菌均有顯著的抗真菌作用。丁雄等[24]對(duì)龍腦樟鮮葉揮發(fā)油成分研究時(shí)發(fā)現(xiàn)龍腦對(duì)細(xì)菌、酵母菌和霉菌均有一定的抑菌作用。王雪梅等[25]研究發(fā)現(xiàn)檸檬烯對(duì)真菌的抑菌活性比梨酸鉀和苯甲酸鈉更有優(yōu)勢(shì)，對(duì)灰葡萄孢菌的抑制顯著高于月桂烯。因此，在迷迭香精油抑制真菌生長(zhǎng)的過程中起主要作用的成分可能是馬鞭草烯酮、香葉醇、芳樟醇、龍腦和檸檬烯。

由圖3e可知，中香葉天竺葵油分離出41種成分，主要成分為β-香茅醇(48.74%)、甲酸香草酯(16.33%)、薄荷酮(6.29%)、β-人參烯(3.33%)、香葉醇(2.34%)、惕各酸苯乙酯(2.25%)。廖澤東等[26]通過體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究香葉醇與檸檬醛聯(lián)合使用對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性，發(fā)現(xiàn)兩者具有協(xié)同作用。Ortega-Ramirez等[27]的研究表明，檸檬醛和香葉醇抑制大腸桿菌的浮游生物生長(zhǎng)，最小抑菌濃度僅1.0和3.0 mg/mL。吳建挺[28]研究發(fā)現(xiàn)，香茅醇和薄荷酮對(duì)灰葡萄孢和禾谷鐮刀菌均表現(xiàn)出突出的抑菌活性。檸檬醛雖在精油含量中所占比例不大，但抑菌效果較強(qiáng)[29]。香葉天竺葵油成分中的β-香茅醇、香葉醇、薄荷酮和檸檬醛均表現(xiàn)出不同的抑菌活性，本研究也表明了香葉天竺葵油有較好的抑菌活性。

2.4 水楊酸甲酯的最小抑菌濃度

抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果表明，冬青油對(duì)綠木霉、黑曲霉和桔青霉的抑菌效果較好，而且成分分析中僅檢測(cè)出水楊酸甲酯1種成分。因此，本研究進(jìn)一步測(cè)定分析純水楊酸甲酯試劑對(duì)3種霉菌的最小抑菌濃度，結(jié)果見表2。由表2可知，水楊酸甲酯與冬青油的最小抑菌濃度結(jié)果一致，表明水楊酸甲酯試劑與天然提取的冬青油對(duì)綠木霉、黑曲霉和桔青霉具有相同的抑菌效果。

表2 水楊酸甲酯的最小抑菌濃度Table 2 The minimum inhibitory concentrations of methyl salicylate

3 結(jié) 論

云南省植物資源豐富，為植物精油的提取提供了充足的原料。本研究探索了冬青、藍(lán)桉、互葉白千層、迷迭香和香葉天竺葵中揮發(fā)油的抑菌活性和成分。從抑菌效果來看，冬青油和香葉天竺葵油對(duì)綠木霉、黑曲霉和桔青霉的抑制作用均明顯優(yōu)于藍(lán)桉油、互葉白千層油和迷迭香油；互葉百千層油和迷迭香油對(duì)3種霉菌的抑菌活性較弱；藍(lán)桉油對(duì)3種霉菌的抑菌效果最差。最小抑菌濃度結(jié)果顯示，冬青油對(duì)桔青霉、綠木霉和黑曲霉的最小抑菌濃度區(qū)間為0.13～0.25 μL/mL；香葉天竺葵油僅次于冬青油。通過GC-MS分析和分析純水楊酸甲酯最小抑菌試驗(yàn)推斷，冬青油中起抑菌作用的是水楊酸甲酯；藍(lán)桉油最主要成分是1,8-桉葉素，占82.38%；互葉白千層油、迷迭香精油和香葉天竺葵油分別有36，38和41種成分，3種精油中最主要的成分都是醇類化合物，分別占53.63%，45.80%和51.44%。除冬青油僅有水楊酸甲酯一種成分外，其他4種植物精油成分復(fù)雜，其抑菌作用可能是由成分之間相互協(xié)同作用的結(jié)果。本研究不僅促進(jìn)了對(duì)精油抑菌性能的了解，更為下一步研發(fā)復(fù)合精油抑菌產(chǎn)品提供了思路。