HPLC-RID同時測定艾納香油中5種活性成分的含量

陳前袆 ，曹春月 ，陳偉，王魯，何珺*

1. 貴州大學藥學院（貴陽 550025）；2. 西南特色藥用生物資源開發利用教育部工程研究中心（貴陽 550025）

艾納香（Blumea balsamifera（L.）DC）為菊科艾納香屬多年生木質草本植物[1]，是提取艾納香油、艾片以及艾粉的天然原料。艾納香油可通過對艾納香進行水蒸氣蒸餾法、浸提法或溶劑提取法提取得到，其中主要含有L-龍腦、芳樟醇、樟腦、花椒油素、1-辛烯-3-醇、β-蒎烯、α-葎草烯等多種活性成分[2-3]。左旋龍腦[4]、芳樟醇[5-6]、樟腦[7]等具有很好的抑菌抗炎作用，花椒油素[8]具有抑制血小板聚集作用，1-辛烯-3-醇可用于食品添加劑。艾納香油被廣泛應用于藥品行業，是我國貴州省特色藥例“咽立爽滴丸”“萬金香氣霧劑”等的主要原料[9]。

目前關于艾納香油的報道主要集中于艾納香油的藥理作用[10-11]、GC-MS化學成分分析[12]方面，GC檢測艾納香油中活性成分含量也有部分報道。陳寶雯等[13]建立了同時測定艾納香油中β-蒎烯、芳樟醇、L-樟腦、L-龍腦、β-石竹烯、花椒油素含量的方法。吳麗芬等[14]建立GC法同時測定艾納香油中β-蒎烯、芳樟醇、樟腦、L-龍腦、β-石竹烯5個成分的含量。陳貴等[15]建立GC法同時測定艾納香油中左旋龍腦、樟腦、β-石竹烯3種成分的含量。對于建立艾納香油液相測定方法還未見報道，而利用HPLC檢測手段測定左旋龍腦、β-石竹烯等已有部分報道。例如：RP-HPLC測定艾納香中花椒油素的含量[16]；HPLC-RID同時測定咽立爽口含滴丸中樟腦、石竹烯、龍腦、異龍腦含量[17]。此次試驗建立HPLC-RID同時測定艾納香油中花椒油素、樟腦、1-辛烯-3-醇、左旋龍腦及芳樟醇5種活性成分的含量，其中關于艾納香油中1-辛烯-3-醇的含量測定還未見有相關報道。此次試驗建立的HPLC-RID方法可為今后艾納香油的質量控制及開發利用提供參考依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與設備

BT25S型電子分析天平：塞多利斯科學儀器（北京）有限公司；安捷倫1100型液相分析色譜儀（RID檢測器，安捷倫科技有限公司）；C18高效液相色譜柱（日本島津分析儀器有限公司）；其他為一般常規儀器。

1.2 對照品

芳樟醇對照品（批號BCBV9483，德國SIGMA公司）；花椒油素對照品（批號AW13，Absin公司）；1-辛烯-3醇對照品（批號BCBV4944，德國SIGMA公司）；左旋龍腦對照品（批號B118615，Aladdin公司）、樟腦對照品（批號HH5S-R43G，中國食品藥品檢定研究所）。上述對照品均供含量測定用。

1.3 樣品

艾納香油于2017年11月3日分別購自貴州省羅甸縣紅水河鎮平亭村（S1）、貴州省羅甸艾利康藥業（S2）、貴州省羅甸全興藥業（S3）、貴州省羅甸艾原生態藥業（S4）；2016年11月6日購自貴州省羅甸艾利康藥業（S5）；2015年購于貴州省羅甸艾利康藥業（S6）。2018年12月購自貴州省望謨（S7）；2019年購自江西海麟香料有限公司6批：其生產時間分別為2019年10月（S8），2019年9月（S9），2018年1月（S10），2016年4月（S11），2017年5月（S12）和2019年11月（S13）。

1.4 試劑

甲醇（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 供試品儲備液的制備

供試品儲備液的制備：分別取50 mg S1～S13樣品，加甲醇溶解并定容至5 mL，作為供試品溶液儲備液。

2.2 混合對照品及供試品溶液的制備

混合對照品溶液的制備：取適量花椒油素對照品、樟腦對照品、1-辛烯-3-醇對照品、左旋龍腦對照品、芳樟醇對照品，加甲醇定容至5 mL，制成質量濃度分別為0.279，0.362，0.455，0.430和0.448 mg/mL的溶液，作為混合對照品溶液。

供試品溶液的制備：分別取0.5 mL 2.1小節制備的供試品儲備液，加甲醇定容至3 mL，得供試品溶液。

2.3 色譜條件

Supersil-T C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相甲醇-水（60∶40，V/V）等度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量5 μL。

3 結果與分析

3.1 系統適用性

精密量取5 μL 2.2小節制備的同一批供試品溶液與混合對照品溶液進行HPLC分析，記錄色譜圖，見圖1和圖2。

圖1 混合對照品HPLC圖

圖2 艾納香油樣品HPLC圖

3.2 線性關系考察

精密吸取適量2.2小節制備的不同體積混合對照品溶液，分別置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得到系列濃度的混合對照品溶液。分別精密吸取5 μL系列濃度的混合對照品溶液進行HPLC-RID分析。以左旋龍腦、芳樟醇、花椒油素等5種對照品的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行回歸分析，結果見表1。取適量各對照品溶液，用甲醇稀釋成不同濃度后直接進樣，直到某一濃度出峰是儀器噪音的3倍時，得到儀器檢出限，再乘以方法的稀釋倍數除以方法的稱樣量得到方法的檢出限。

表1 艾納香油中5種成分的線性關系考察結果

3.3 精密度試驗

精密吸取5 μL 2.2小節制備的混合對照品溶液進行HPLC-RID分析，重復進樣6次進行HPLC-RID分析，記錄色譜圖。測得花椒油素、樟腦、1-辛烯-3-醇、左旋龍腦及芳樟醇的相對標準偏差RSD，分別為0.90%，0.53%，0.92%，0.64%和0.74%。表明儀器的精密度良好。

3.4 重復性試驗

精密稱取6份同一供試品，按2.1小節對供試品進行溶解并定容，得到供試品溶液，分別精密吸取5 μL上述供試品溶液進行HPLC-RID分析，記錄色譜圖。測得花椒油素、樟腦、1-辛烯-3-醇、左旋龍腦及芳樟醇的相對標準偏差RSD，分別為0.59%，1.12%，1.27%，1.26%和1.29%。表明此方法重復性良好。

3.5 穩定性試驗

精密吸取6份5 μL 2.1小節制備的同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12和24 h在上述最佳色譜條件下進行HPLC-RID分析，記錄色譜圖。測得花椒油素、樟腦、1-辛烯-3-醇、左旋龍腦及芳樟醇的相對標準偏差RSD，分別為0.90%，1.42%，1.48%，1.49%和1.18%。表明艾納香油樣品在24 h內穩定性良好。

3.6 加樣回收率試驗

分別精密量取適量2.2小節制備的同一批供試品溶液，添加低（80%）、中（100%）、高（120%）三個水平的標樣，溶解，搖勻，得到該試驗項下的供試品溶液，備用。精密量取5 μL供試品溶液，在上述最佳色譜條件下進樣測定并記錄色譜圖。測得花椒油素、樟腦、1-辛烯-3-醇、左旋龍腦、芳樟醇的平均回收率，分別為99.626 9%（RSD=1.15%），100.500%（RSD=1.29%），99.575%（RSD=0.97%），99.634%（RSD=1.45%）和99.614%（RSD=1.45%）。

表2 艾納香油中各活性成分的加樣回收率試驗結果（n=3）

3.7 樣品含量測定結果

精密吸取5 μL 2.1小節制備的13批供試品儲備液，測定1-辛烯-3-醇和芳樟醇的總含量，重復測定3次，記錄色譜圖。精密吸取5 μL 2.2小節制備的13批供試品溶液，測定花椒油素、樟腦及左旋龍腦的總含量，重復測定3次，記錄色譜圖。計算出各批次艾納香油各活性成分的含量范圍：花椒油素26.264～54.410 mg/g、樟腦26.065～66.745 mg/g、1-辛烯-3-醇6.171～ 15.341 mg/g、左旋龍腦83.678～151.762 mg/g和芳樟醇4.780～12.953 mg/g。

表3 13批艾納香油中各活性成分的含量測定結果（n=3） mg/g

4 討論與結論

前期利用HPLC-DAD技術對該5種活性成分進行含量測定探究，其中左旋龍腦對照品與樟腦對照品在HPLC-DAD技術下其紫外吸收十分弱，以至于在紫外下幾乎無峰出現，艾納香油樣品中的左旋龍腦在紫外下也無峰顯現，同時1-辛烯-3醇、芳樟醇的紫外吸收也相對較弱，使得樣品中該2種活性成分的峰很小，而花椒油素的紫外吸收較強，在常用360 nm下仍有紫外吸收，但是出峰時間相對較長，因此HPLC-DAD技術無法同時測定左旋龍腦、花椒油素、芳樟醇、1-辛烯-3-醇及樟腦的含量，并浪費時間與試劑。相對HPLC-DAD技術，此次試驗采用的HPLC-RID方法簡單，操作簡便，且各活性物質的出峰時間很短，能同時測定該5種活性成分的含量，因此節省了大量的時間、精力及金錢。

在流動相選擇上，比較了70%甲醇水、60%甲醇水和50%甲醇水對艾納香油樣品中活性成分分離度的影響，結果表明60%甲醇水較為適宜，70%甲醇水條件下樣品的分離度差，分離不好，50%甲醇水條件下艾納香油樣品出峰時間過長，樣品的峰面積低，故綜合選擇60%甲醇水為最佳流動相。

此次試驗建立了HPLC-RID方法檢測樟腦、1-辛烯-3-醇、左旋龍腦、花椒油素與芳樟醇的含量。色譜條件：Supersil-T C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相甲醇-水（60∶40，V/V）等度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量5 μL。艾納香油中花椒油素、樟腦、1-辛烯-3-醇、左旋龍腦與芳樟醇的含量范圍分別為26.264～54.410，26.065～66.745，6.171～15.341，83.678～151.762和4.780～12.953 mg/g。試驗表明，不同批次的艾納香油中相同活性成分的含量差異較大，整體情況而言，左旋龍腦的含量最高，1-辛烯-3-醇的含量較低。此次試驗所建立的液相檢測方法操作簡便，樣品處理簡便化；通過相關的方法學驗證表明方法專屬性強，檢測靈敏度高，回收率好，重復性高，分析準確，為今后艾納香油的質量控制提供參考依據，以及為只有HPLC沒有GC的中藥廠家及科研單位提供另一種檢測方法，同時為艾納香油質量控制與藥效基礎研究提供不同的檢測方法，為艾納香油質量檢測及綜合控制奠定基礎。