LC-MS/MS測定果汁飲料中乳酸鏈球菌素

陳召桂，楊晉青，朱玲琳

1. 浙江五芳齋實業股份有限公司（嘉興 314031）；2. 上海市質量監督檢驗技術研究院（上海 200233）

乳酸鏈球菌素（Nisin）是一種由部分乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）或乳酸鏈球菌（Streptococcus uberis）菌株產生的一種陽離子多肽，能夠有效抑制大多數革蘭氏陽性細菌的生長。乳酸鏈球菌素作為一種新型天然的生物防腐劑，較之傳統防腐劑苯甲酸鈉、山梨酸鉀、丙酸鹽、富馬酸二甲酯，具有效果好、用量少、對人和生物生存環境沒有破壞和副作用等優點[1-4]。GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[5]規定乳酸鏈球菌素使用范圍和最大使用量，在飲料（14.01包裝飲用水除外）中的最大使用量為0.2 g/kg（固體飲料按沖調倍數增加使用量）。國內外對乳酸鏈球菌素的檢測方法研究成果較少，目前主要是使用瓊脂擴散法、酶聯免疫吸附法、高效液相色譜法、高效液相色譜質譜法等[6-9]。這些檢測方法各有優缺點，而高效液相色譜-串聯質譜法具有溶劑用量小、分離效率高、檢測靈敏度高、假陽性低等優勢[10]。目前針對飲料中乳酸鏈球菌素的檢測鮮有報道，故此次試驗采用超高效液相色譜-串聯質譜對果汁飲料中乳酸鏈球菌素進行檢測，從而彌補這方面的空白，為乳酸鏈球菌素的檢測方法標準的建立提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；乳酸鏈球菌素標準品（Sigma公司）。

乳酸鏈球菌素標準儲備液（1.0 mg/mL）：稱取0.100 0 g乳酸鏈球菌素于100 mL容量瓶中，用含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液溶解并定容至刻度，存放于4 ℃冰箱中備用。

乳酸鏈球菌素標準工作液：取1.0 mL乳酸鏈球菌素標準儲備液，用含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液溶劑稀釋至1.0 mg/L，備用。

乳酸鏈球菌素標準工作曲線溶液：用含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液稀釋乳酸鏈球菌素標準工作液，使其質量濃度分別為100，80，50，20，10和5 μg/L。

1.1.2 儀器與設備

Agilent 1290液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；AB SCIEX QTRAP?6500質譜儀（美國Sciex公司）；TB-114型分析天平（Mettler Toledo公司）；渦旋混合器（德國IKA公司）；超聲波清洗器（上海鯨德公司）；高速離心機（Eppendorf公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 液相色譜-串聯質譜條件

色譜柱Agilent PLRPS-S C18（2.1 mm×150 mm，3.0 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脫；流速為200 μL/min；柱溫為30 ℃；進樣體積為20 μL。

質譜條件：離子化方式，ESI；掃描方式，正離子掃描；檢測方式，多反應監測（MRM）；氣簾氣（CUR）10.0 psi；霧化氣（GS1）40.0 psi；加熱氣（GS2）10.0 psi；噴霧電壓（IS）5 000 V；去溶劑溫度（TEM）400 ℃；去簇電壓（DP）70 V；定量離子對m/z667.2/805.4，碰撞能（CE）20 eV；定性離子對m/z667.2/739.1，碰撞能（CE）20 eV。

1.2.2 樣品前處理條件

準確稱取5.00 g試樣于50 mL離心管中，加入50.0 mL含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液，渦旋1 min，超聲5 min，以9 000 r/min離心1 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾，濾液作為待測溶液。

2 結果與分析

2.1 質譜方法

使用10 μg/mL乳酸鏈球菌素標準溶液，通過流動注射泵進入質譜進行母離子和子離子掃描優化，得到乳酸鏈球菌素的母離子、子離子及碰撞能量等質譜采集參數，如表1所示，其中m/z667.2/805.4為定量離子。

表1 質譜采集參數

2.2 液相色譜方法

2.2.1 色譜柱選擇

乳酸鏈球菌素屬于大分子類物質，色譜柱的大小、顆粒形狀及粒徑、顆粒表面積、孔徑、封端技術等對其分離度有決定性影響，因此選擇實驗室常用XDB-C18、SB-C18、PLRPS-S-C18等色譜柱對乳酸鏈球菌素標準品進行分離研究，以便找出合適的色譜柱。最終發現PLRPS-S-C18柱效高、選擇性好、分析速度快，因此將其作為乳酸鏈球菌素的檢測。

就國內其它行業成功實施案例分析來看，為了在當下的環境下更好地生存與發展，充分地利用了信息化和移動化的技術手段，并引入了先進的JIT（準時至）的管理理念，對鐵路企業審批業務環節上進行了改革性的創新和應用，讓審批業務由線下操作成功的轉型到線上操作，不僅大大提高了工作的效率，同時也節約了大量的時間成本和資源的消耗，取得很好的應用效果。具體效果體現在以下幾個方面：

2.2.2 流動相的選擇

流動相的種類及配比直接影響組分的分離，因此需要對流動相組成選擇進行優化。因Nisin易溶于水，極性較強，質譜電離時帶多個正電荷，故選擇有機相-甲酸水體系作為流動相。使用100 ng/mL的乳酸鏈球菌素標準溶液進行液相色譜方法優化，分別選擇甲醇-質量分數0.1%甲酸水和乙腈-質量分數0.1%甲酸水作為流動相進行梯度洗脫，洗脫梯度條件如表2所示。其中A相為質量分數0.1%的甲酸水溶液，B相為有機相，比較發現使用乙腈-質量分數0.1%甲酸水作為流動相時，洗脫能力好，質譜響應高且色譜峰較窄，故選擇乙腈-質量分數0.1%的甲酸水溶液作為乳酸鏈球菌素檢測的流動相。色譜圖如圖1所示。

表2 梯度洗脫條件

圖1 乙腈-0.1%甲酸水的梯度洗脫色譜圖

2.3 樣品前處理方法

2.3.1 提取溶劑的選擇

由于乳酸鏈球菌素易溶于水，并且溶解度隨著pH的降低而顯著增加，不能完全溶解于純的甲醇、乙腈等有機溶劑，所以選擇水、乙腈水溶液、含0.1%甲酸的乙腈水溶液分別作為提取溶劑，考察這3種不同提取溶劑對果汁飲料中乳酸鏈球菌素的提取效果。試驗選取蘋果汁飲料為基質樣品，稱取5.0 g試樣并向其中加入500 μg/kg的乳酸鏈球菌素標準品，分別選用水、20%乙腈水溶液、含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液作為提取溶劑，然后對其進行超聲提取（提取相同時間），重復測定6次，考察提取效率，結果見表3。

3種提取溶劑均能提取飲料中乳酸鏈球菌素。水對乳酸鏈球菌素提取效率較差，含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液提取效率明顯較高，而且純水難以過濾上機，存在雜質難以沉淀的問題，不便于前處理過程；含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液明顯高于乙腈水溶液，而且考察到乳酸鏈球菌素在低pH下的溶解度較好，因此選擇含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液作為最終的提取溶劑。

表3 不同提取溶劑對果汁飲料中乳酸鏈球菌素的提取效率

2.3.2 超聲時間和溫度的選擇

超聲提取時間是對測定結果影響較大的因素之一，因此選取不同的超聲時間進行試驗。分別選取5，10，15，20和30 min，在相同條件下進行分析測定，結果見表4。結果表明，隨著超聲提取時間的延長，提取效果提高不明顯。由于樣品是可溶性液體類飲料，乳酸鏈球菌素基本溶解在其中，只需滿足基質效應低的提取溶劑下提取，故選擇超聲提取時間10 min。

表4 不同提取時間對果汁飲料中乳酸鏈球菌素的提取效率

2.3.3 線性范圍與檢出限

分別取20 μL質量濃度為100，80，50，20，10和5 μg/L乳酸鏈球菌素標準液，按上述色譜-質譜條件進行分析。以相應的色譜峰面積（y）為縱坐標、待測組分的質量濃度x（μg/L）為橫坐標，繪制標準工作曲線，經線性回歸求得相關系數，結果見表3。結果表明待測組分在該濃度范圍內均具有良好的線性關系。

檢出限定義：響應信號為噪音的3倍（S=3N）時所需的樣品量；定量限定義：響應值為10倍基線噪音時所需的樣品量。當取樣量為5.0 g時，將一定濃度的乳酸鏈球菌素標準樣品添加在空白基質樣品中，定容體積為50.0 mL，在相同檢測條件下進樣6針，按檢出限的定義分析數據，結果如表6所示。乳酸鏈球菌素的檢出限為20 μg/kg，定量限為50 μg/kg。

表5 線性范圍

表6 檢出限結果

2.3.4 方法回收率和精密度

選取陰性空白樣品基質（蘋果果汁），分別添加低、中、高3個濃度水平（50，100和500 μg/kg），每一個添加水平重復測定6次，其回收率和精密度結果如表7所示?？梢钥闯觯厥章试?9.5%～111.5%之間，且相對標準偏差（RSD）＜10%，能夠滿足試驗要求。

表7 回收率和精密度試驗結果（n=6）

2.3.5 市售樣品分析

采集30個市售果汁飲料樣品，按照樣品處理方法對樣品進行處理，根據儀器分析方法，對樣品中的乳酸鏈球菌素上機分析，樣品中均未檢出乳酸鏈球菌素，可能是由于乳酸鏈球菌素較化學防腐劑價格較貴等原因，在果汁飲料領域使用較少。

3 結論

通過優化色譜條件和質譜條件，選擇合適的提取溶溶液類型以及相應體積，建立LC-MS/MS測定果汁飲料中乳酸鏈球菌素含量的檢測方法。該方法靈敏、準確、專一性強，適用于果汁飲料中乳酸鏈球菌素的定性與定量檢測，可為果汁飲料中超限量使用添加劑提供有力的技術支撐，也為拓展到其他食品中乳酸鏈球菌素的檢測提供理論基礎。