攀枝花土蜂蜜酒發酵條件的優化

李敏杰，熊亞

1. 攀枝花學院生物與化學工程學院（攀枝花 617000）；2. 攀枝花市干熱河谷特色生物資源工程技術中心（攀枝花 617000）

蜂蜜酒是以蜂蜜為原料，經過稀釋、調整、發酵、澄清、過濾、陳釀后所獲得的低度酒精飲料[1]。蜂蜜的主要成分是葡萄糖、果糖及其他高級營養成分，因此以蜂蜜為原料釀造的蜜酒對人體具有很強的保健作用[2]。蜂蜜酒中含有多種維生素、礦物質和人體必需的18種氨基酸等，對治療失眠、健忘、精神不振、性功能衰退等有良好的輔助作用，對胃腸慢性病、慢性支氣管炎、哮喘等痼疾有良好作用[3]。此次試驗選取產自攀枝花老鹽邊大山深處的土蜂蜜，相比傳統農家蜂蜜以及意蜂蜜而言，土蜂蜜在美容、減肥、養生方面效果更好。

近年來，以蜂蜜為原料生產的蜂蜜酒，其保健功能集蜂產品和發酵產品為一身，以保健酒為基礎的蜂蜜酒開發更具特色[4]，對蜂蜜酒的釀制已經不僅僅局限于純蜂蜜釀酒，更多的蜂蜜保健酒開始出現在市場、民間作坊中，如綠茶蜂蜜酒[5]、紅曲蜂蜜酒[6]、發酵型五味子蜂蜜果酒[7]、紅棗蜂蜜保健酒[8]等。對各種類型蜂蜜酒的研制更加注重發酵工藝的優化，章芒芒等[9]采用正交設計的統計學方法，對蜂蜜酒主發酵的最佳條件進行了研究，得出溫度、尿素添加量、磷酸銨比例、pH及酵母接種量、發酵周期的最佳值；王淼[10]則從發酵溫度、總酸度、溶解氧及菌數控制等方面對蜂蜜酒發酵參數進行了最優化組合；陶樹興等[11]通過蜂蜜酒發酵及雜醇油含量的變化，探討了氮源種類和濃度對它們的影響，為蜂蜜酒的釀造提供了一定的參考。目前，利用響應面法對蜂蜜酒發酵條件優化的研究報道還很少。此次試驗以攀枝花土蜂蜜為原料，以土蜂蜜酒發酵產酒精度為響應值，采用單因素試驗和響應面分析法對土蜂蜜酒發酵條件進行優化，以期為攀枝花土蜂蜜的開發應用提供一定的參考價值。

1 試驗材料及方法

1.1 試驗材料

攀枝花土蜂蜜（攀枝花市售）；酵母（安琪高活性酵母，湖北宜昌安琪酵母股份有限公司）；亞硫酸（99.8%，成都科龍化工試劑廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

土蜂蜜→稀釋→滅菌鍋殺菌30 min→冷卻到25～30 ℃→加酵母（活化35 min）→主發酵→澄清→陳釀后發酵→過濾→調配

稱取300 g的土蜂蜜，加1 L的蒸餾水稀釋，于110 ℃滅菌30 min。冷卻后裝入發酵罐，加入活化后的酵母，調節pH，放入恒溫箱進行發酵。發酵結束后，倒罐、過濾[12]，低溫下進行陳釀，檢測酒精度。

1.2.2 單因素試驗

選用pH、溫度、酵母菌添加量及通氣量4個因素，按照不同的pH（3.0，3.5，4.0，4.5，5.0和5.5）、溫度（15，20，25，30和35 ℃）、酵母菌添加量（1%，2%，3%，4%，5%和6%）、通氣量（0，1，2，3和4次/d）進行單因素試驗，檢測土蜂蜜酒發酵的酒精度。

1.2.3 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，利用SAS 9.2軟件中Box- Behnken設計原理，進行四因素三水平的響應面分析和數據處理，以pH（X1）、溫度（X2）、酵母菌添加量（X3）及通氣量（X4）為自變量，以酒精度（Y）為響應值，確定各因素對響應值的影響，得到土蜂蜜酒發酵的最佳條件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 pH對土蜂蜜酒酒精度的影響

由圖1可知，當pH為4.5時，土蜂蜜酒的酒精度達到最高，為9.6%vol。酵母菌的生長對pH比較敏感，pH過低或pH過高均會抑制其生長，從而影響酒精的生成。

圖1 pH對土蜂蜜酒酒精度的影響

2.1.2 發酵溫度對土蜂蜜酒酒精度的影響

由圖2可知，當溫度升高時，酒精度也上升，這是由于酵母菌的生長發育及代謝活動受溫度影響比較大。酵母菌的一切生理活動與酶的活力相關，而酶活力要在最佳溫度范圍內才得以發揮。當溫度超過25 ℃時，酵母菌離開了最適溫度范圍，生長代謝變慢，所以酒精度也開始下降。因此選擇發酵溫度25 ℃。

2.1.3 酵母添加量對土蜂蜜酒酒精度的影響

由圖3可知，增加酵母添加量可以使生成的酒精度增加，這是由于足夠的酵母菌添加比例，可以快速地使酵母菌在發酵醪液中占據優勢地位，抑制雜菌的生長，從而使酒精生成量增加。而當酵母菌濃度超過4%時，由于發酵醪液中的營養物質有限，酵母菌的生長在后期會放緩，造成早衰，使酒精生成量下降。所以酵母菌接種量在4%時最適宜。

圖2 發酵溫度對土蜂蜜酒酒精度的影響

圖3 酵母菌添加量對土蜂蜜酒酒精度的影響

2.1.4 通氣量對土蜂蜜酒酒精度的影響

酵母菌的生長繁殖需要氧參與，所以提供必要的通氣量對酒精度的生成有益。但是由于酒精生成是厭氧過程，過多的通氧會導致葡萄糖完全氧化為二氧化碳、水和能量，減少酒精的生成。由圖4中可知，當通氣量為1次/d時，酒精生成量達到最大。

圖4 通氣量對土蜂蜜酒酒精度的影響

2.2 響應面分析

2.2.1 選取響應面分析的因素及水平

根據單因素試驗結果，進行四因素三水平的響應面試驗分析，其因素與水平見表1。

表1 響應面分析因素與水平

2.2.2 響應面試驗方案及結果

對pH（A）、發酵溫度（B）、酵母添加量（C）及通氣量（D）作如下變換：X1=（A-4.5）/0.5，X2=（B-25）/5，X3=（C-4）/2，X4=（D-1）/1。以X1、X2、X3、X4為自變量，酒精度為響應值（Y），方案及結果見表2。

表2 響應面試驗方案及試驗結果

從表3可知，模型的p=0.000 1＜0.01，表明模型方程極顯著。失擬項p值=0.065 4＞0.05，說明方程對試驗的擬合度良好，此方法可靠。X2、X3、X4對Y有顯著性影響，X2、X4為正效應，X3為負效應，X2影響極顯著；二次項X22、X32對Y也有顯著影響，均為負效應，X32影響極顯著。其余變量的影響均不顯著（p＞0.05）。結合表3各項數值可以分析出，各因素對土蜂蜜酒酒精度的影響程度依次為溫度、酵母菌添加量、通氣量、pH。

2.2.3 土蜂蜜酒發酵條件優化的響應面及等高線圖

響應面圖形是響應值Y酒精度對各試驗因子X1、X2、X3、X4的函數圖形，可以選擇出試驗設計中的最優化條件，從響應面圖形上可以得出最佳參數及各參數之間的相互作用[13]，響應面分析等高圖直觀地反映出各因素交互作用對響應值的影響[14]。土蜂蜜酒發酵條件響應面分析及等高線圖見圖5～圖10。

分別對二次回歸方程的X1、X2、X3、X4求一階偏導，求解，得：X1=-0.279 6，X2=1.367 1，X3=-0.203 3，X4=0.621 8。代入變換公式X1=（A-4.5）/0.5，X2=（B-25）/5，X3=（C-4）/2，X4=（D-1）/1。可得pH為4.36，發酵溫度為31.8 ℃，酵母菌添加量為3.59%，通氣量最多為2次/d。在此條件下，蜂蜜酒發酵酒精度的理論值為11.6%vol。

表3 回歸分析結果

圖5 Y=f (X1, X2)的響應面及等高線圖

圖6 Y=f (X1, X3)的響應面及等高線圖

圖7 Y=f (X1, X4)的響應面及等高線圖

圖8 Y=f (X2, X3)的響應面及等高線圖

圖9 Y=f (X2, X4)的響應面及等高線圖

圖10 Y=f (X3, X4）的響應面及等高線圖

2.2.4 驗證試驗

為驗證響應面法所得結果的可靠性，在上述最佳發酵條件下重復土蜂蜜酒發酵3次，測得的平均酒精度為11.1%vol，與模型預測值11.6%相接近，可見模型能較好地預測實際土蜂蜜酒發酵酒精度的情況，所以基于響應面優化的土蜂蜜酒發酵條件參數比較可靠。

3 結論

采用響應面優化土蜂蜜酒發酵條件得到的酒精度的回歸方法，通過方差分析，證明方程對試驗的擬合度良好。對土蜂蜜酒酒精度影響因素的排名依次為溫度、酵母菌添加量、通氣量、pH。土蜂蜜酒發酵最佳參數為pH 4.36、發酵溫度31.8 ℃、酵母菌添加量3.59%、通氣量2次/d。在此條件下，土蜂蜜酒發酵產酒精度的理論值為11.6%vol，與驗證試驗11.1%vol比較接近。此款土蜂蜜酒顏色金黃，有蜂蜜的清香，酒香濃郁，口味獨特，為攀枝花土蜂蜜的開發應用提供一定的參考價值。