不同分期結直腸癌間質病理特征與預后及淋巴結轉移的相關性

王景林，劉雪影，李 珀，項一寧，李大歡，許良璧

結直腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一。結直腸癌的淋巴結轉移，與患者的預后密切相關。探尋結直腸癌淋巴結轉移的危險因素，是完善結直腸癌“精準治療”的重要一環。既往文獻報道[1]，可預測結直腸癌預后及淋巴結轉移風險的標志物有40多種，目前美國癌癥協會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第8版 分 期 系統推薦推薦腫瘤退縮評分、環周切緣等病理學標志以及K-RAS基因突變、N-RAS基因突變、v-raf鼠類肉瘤濾過性病毒致癌基因同源體B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基因突變等分子生物學標志作為結直腸癌預后及療效預測的指標，但尚缺乏結直腸癌間質病理特征與結直腸癌預后及淋巴結轉移關系的系統分析。本研究擬通過對不同分期結直腸腫瘤患者的間質病理特征[腫瘤-間質比（tumorstroma ratio，TSR）、腫瘤出芽（tumor budding，TB）、腫瘤浸潤前端癌相關性成纖維細（cancer associated fibroblasts，CAFs）細胞形態以及腫瘤腺體富集區域癌性間質反應（desmoplastic reaction，DR）程度]與患者預后及淋巴結轉移的相關性進行分析，評估間質病理特征與結直腸癌預后及淋巴結轉移的關系，從空間分布、時間分布、不同組成部分就癌性間質的特征進行探索性研究，進一步了解癌性間質在結直腸癌進程中發揮的作用，及其與淋巴結轉移、預后的相關性，以期為結直腸癌患者的分層管理，提供新的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究為回顧性研究。共收集148例2014—2017年由貴州醫科大學附屬醫院收治的，經內鏡和（或）外科手術取得組織標本后病理確診為結直腸癌患者的資料。其中男性73例，女性75例；中位年齡64歲（范圍：26～87歲）。患者的基本臨床資料見表1。

所有患者的間質病理特征來源于患者既往手術后醫院保存的用10%甲醛溶液處理后的石蠟包埋組織，選用有代表性的組織塊重新進行連續切片后行HE染色。該回顧性研究設計及實驗方案符合赫爾辛基宣言要求，并得貴州醫科大學附屬醫院倫理委員會批準（批準文號：2019003K）。

1.2 納入和排除標準

樣本量計算：假設在α＝0.05（雙側）的顯著水平下有90%的把握度檢測到組間差異，PASS樣本分析軟件計算顯示，本研究最少需要44例患者（若為2組則分別為22例）即可滿足研究需求。收集高級別上皮內瘤變（high grade intraepithelial neoplasia，HGIN）和（或）或結直腸腺癌者的疾病信息，如性別、年齡、吸煙狀況、飲酒狀況、腫瘤部位、是否合并淋巴管浸潤、是否合并神經/血管侵犯、TNM分期浸（根據AJCC制訂的第8版結直腸腫瘤分期標準進行判定）。

納入標準：（1）年齡＞18歲，性別不限；（2）于本院內鏡中心行內鏡切除、內鏡下黏膜切除術、內鏡下黏膜剝離術或外科手術（根治手術、姑息手術）治療者；（3）術前未行放療或化療、生物及腫瘤免疫治療者；（4）術后有完整的臨床病理資料，且明確診斷為HGIN和（或）或結直腸腺癌者。

排除標準：（1）明確診斷為炎性反應性腸病惡變、Peutz-Jeghers綜合征、家族性腺瘤性息肉病及Lynch綜合征的患者；（2）合并嚴重的心、肺基礎疾病者；（3）合并嚴重的血液系統疾病及凝血功能障礙者；（4）妊娠狀態者；（5）因術后并發癥死亡者；（6）術后病理活檢診斷為非腺癌的其他腫瘤者。

1.3 隨訪資料

本研究采用電話隨訪的聯系方式，隨訪截止日期為2019年11月10日。隨訪內容包括了解患者術后的隨診及死亡情況，并進行可能的隨訪/復查的宣教。隨訪的終點為隨訪完成的日期或患者的死亡日期，生存時間定義為總生存（overall survival，OS）期，以月為單位。至隨訪結束時失訪10例（隨訪率為93.24%）。

1.4 HE染色及結直腸癌間質病理特征相關標志物的結果判定

調閱患者既往病理診斷資料，閱片后選取含腫瘤浸潤最深部位的組織塊，重新切片后行HE染色。HE染色切片由2位高級職稱病理診斷醫師分別獨立閱片復診。如2位診斷醫師就同一張切片存在不同意見，需經討論后統一。

TSR的判定標準[2-3]：在光學顯微鏡下（放大倍數為100倍）選擇腫瘤組織內間質浸潤最明顯的區域，評估每個視野內腫瘤細胞所占面積（剩余部分即為間質所占的面積），并計算腫瘤組織內部TSR（TSR＝腫瘤實質細胞所占視野面積百分比/間質細胞所占視野面積百分比），以間質所占百分比最高的TSR作為最終取值；為排除癌旁組織的干擾，所選區域的間質四周必須有腫瘤組織包繞。將TSR≥1（即腫瘤實質占百分比≥50%）定義為間質稀少組，將TSR＜1（即腫瘤實質占百分比＜50%）的病例定義為間質豐富組（圖1A）。

TB指在光學顯微鏡下觀察發現，腫瘤浸潤前端沿間質內散在的像芽孢一樣的未分化形態的單個腫瘤細胞或小灶狀腫瘤細胞群[2]。出芽1級0～4個細胞為出芽1級，5～9個細胞為出芽2級，10個以上細胞或細胞團為出芽3級（圖1B）。

腫瘤浸潤最前端CAFs形態的判定標準[3]：首先在低倍光學顯微鏡下（放大倍數為50倍）找到腫瘤浸潤最前端（腫瘤浸潤最深）區域后，切換至高倍鏡下（放大倍數為200倍及400倍）觀察腫瘤細胞和腫瘤腺體間間質的形態。成熟的癌性間質由細長的膠原纖維和紡錘形成纖維細胞組成，而未成熟的癌性間質由黏液樣成分、瘢痕樣膠原束、大而豐滿的CAFs細胞組成。成熟的癌間質成分/未成熟的癌間質成分≥50%定義為成熟；＜50%者定義為不成熟（圖1C）。

腫瘤腺體富集區域癌性DR程度是否成熟的判定[4]：腫瘤腺體最富集區域參考TSR判定標準，即首先在低倍光學顯微鏡下（放大倍數為100倍）下找到腫瘤腺體最密集區域，隨后切換至200倍及400倍下觀察腫瘤細胞和腺體間質的形態。癌性間質反應的成熟度則根據腫瘤-間質中CAFs細胞和細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）的比例，將腫瘤間質中致密粉染的膠原基質構成纖維母細胞（梭形細胞纖細、波浪樣結構、核仁不明顯）占細胞總數比例＜10%定義為成熟型，腫瘤間質中活化的纖維母細胞（胖梭形形態伴顯著細胞核和大核仁）＞50%定義為不成熟型（圖1D）。

1.5 統計學方法

采用R3.6.2（https://www.r-project.org）、R-studio（https://rstudio.com）與SPSS 25.0統 計學軟件對研究數據進行統計學處理。組間生存率差異的比較采用log-rank法；用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并計算平均OS期和中位OS期，Wilcoxon秩和檢驗法評價2組非參數資料間的差別，以P＜0.05為差異有統計學意義。用COX風險比例回歸模型評估患者間質病理特征（腫瘤分化程度、TSR、TB、腫瘤浸潤前端CAFs細胞形態、腫瘤腺體富集區域DR程度）與生存時間的相關性，Logistics回歸分析評價患者病理特征與淋巴結轉移的相關性。

2 結果

2.1 生存時間

本回顧性研究中共納入148例結直腸癌患者，平均OS期為（43.66±20.13）個月（范圍：1～67個月），中位OS期為48.50個月。

2.2 患者臨床與病理資料及其與生存相關性

148例患者中，TSR≥1者114例（77.03%）；TB為1級 者58例（39.19%），2級 者53例（35.81%），3級者37例（25.00%）；腫瘤浸潤前端CAFs細胞形態成熟者42例（28.38%）；腫瘤腺體富集區域DR反應程度成熟者85例（57.43%）。148例患者中，淋巴結轉移陰性者86例（58.11%），淋巴結轉移N1者26例（17.57%），淋巴結轉移N2者36例（31.32%）（表1）。

Kaplan-Meier法生存曲線分析結果（圖2）顯示，神經或血管侵犯、淋巴結轉移、TNM分期、腫瘤分化程度、TSR和TB均與OS期有關，差異有統計學意義（P值均＜0.001）。

2.3 直腸癌患者預后的COX多因素回歸分析

Fig.1 The tumor-stroma ratio (TSR) (A,×100),tumor budding (TB) (B,×200),morphology of cancer associated fibroblasts (CAFs) at the frontline of vertical invasion (C,×200) and desmoplastic reaction (DR) at the centre of tumor glands (D,×200) in colorectal cancer tissues were observed by HE stainging.圖1 HE染色后觀察結直腸癌組織中TRS（A）、TB（B）、腫瘤浸潤最前端CAFs形態（C）以及腫瘤腺體富集區域癌性DR程度（D）

表1 患者的臨床及病理特征Table 1 The clinical and pathological features of patient with colorectal cancer

Fig.2 The overall survival (OS) curves of 148 patients with colorectal cancer on neural or blood vessel invasion (A),lymphatic metastasis (B),TNM staging (C),differentiation (D),tumor-stroma ratio (TSR) (E)and tumor budding (TB) (F) were analyzed by Kaplan-Meire.圖2 Kaplan-Meier法分析神經或血管侵犯侵犯（A）、淋巴結轉移（B）、TNM分期（C）、分化程度（D）、TSR（E）和TB（F）與患者OS期的相關性

COX比例風險回歸模型分析結果（表2）顯示，淋巴結轉移、TSR與TB是影響結直腸癌患者預后的風險因素（P＜0.001，P＜0.05和P＜0.05）。

2.4 結直腸癌間質病理特征情況

浸潤深度、腫瘤分化程度、TB和淋巴結轉移在不同TSR患者中的差異有統計學意義（P值均＜0.001）。TSR＜1（34例）的結直腸癌患者中，垂直浸潤深度均＞pT2，腫瘤分化程度為中分化者20例（58.82%）及低分化者14例（41.18%），且均合并淋巴結轉移（34例，100.00%）（表3）。

86例無淋巴結轉移結直腸癌患者的TSR均≥1（100.00%），TSR、TB和腫瘤浸潤前端CAFs細胞形態在有淋巴結轉移或無淋巴結轉移組中的表達差異有統計學意義（P值均＜0.05）；62例有淋巴結轉移的結直腸癌患者中，TSR＜1者34例（54.84%），為未成熟的腫瘤浸潤前端CAFs細胞形態者51例（82.26%）（表4）。

表2 COX多因素回歸分析病理特征與結直腸腫瘤患者預后的相關性Table 2 COX proportional hazards mode analysis of the relationship between the pathological feature and the prognosis of patient with colorectal cancer

表3 TSR的不同組別之間間質病理特征的差異Table 3 Discrepancy of the stroma pathological feature expression between the different group of TSR

表4 淋巴結轉移的不同組別之間間質病理特征的差異Table 4 Discrepancy of the stroma pathological feature expression between the different group of lymphatic metastasis

2.5 結直腸癌患者間質病理特征與淋巴結轉移的關系

對患者的一般情況及間質病理特征進行Logistics單因素分析，結果（表5）顯示神經或脈管侵犯、腫瘤分化程度、TSR、TB、腫瘤浸潤前端CAFs細胞形態具有統計學意義（P值均＜0.05）。將上述指標納入多因素Logistics回歸分析，結果顯示腫瘤分化程度與TSR是影響結直腸癌患者淋巴結轉移的風險因素。

表5 Logistics回歸分析評估患者臨床及病理資料對淋巴結轉移的影響Table 5 Logistics regression analysis of the relationship between the clinical and pathological feature and lymphatic metastasis

3 討論

據Globol Cancer Statistics 2018[5]的統計，結直腸癌以10.2%的新發病率位于所有腫瘤中的第3位，而死亡率則是9.2%，位居肺癌之后的第2位。關于結直腸腫瘤預后及淋巴結轉移因素的研究，對結直腸腫瘤的診斷和精準治療有著重要的意義。既往關于結直腸癌的研究主要集中于腫瘤的實質細胞。腫瘤的間質通常指代腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME），它由CAFs與ECM構成。隨著對腫瘤認識的不斷加深，腫瘤間質對腫瘤的生長、浸潤、轉移以及細胞免疫等多個層面的影響被不斷地揭示[6]。當腫瘤處于早期局限于黏膜內時，腫瘤細胞的持續出現和積累仍可導致局部組織呈現出反復的“損傷-愈合”過程[7]；腫瘤細胞釋放的生長因子如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）及成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）等，一方面可使原有靜止的成纖維細胞被腫瘤細胞激活并重構，另一方面則促進ECM的增生。此時CAFs仍未完全激活，ECM未大量增生，在TME上則表現為間質比例顯著少于腫瘤實質。有研究發現，在癌癥的早期發展過程中間質可能起到阻礙原位癌的侵襲及轉移的[8-10]。隨著腫瘤的進一步發展，EMT持續發生，不斷地導致腫瘤周圍原有靜止成纖維細胞逐漸向CAFs轉化，并導致ECM的持續增長，間質比例逐漸升高。腫瘤間質對于腫瘤的浸潤、轉移的影響貫穿腫瘤的整個演進過程。

在本研究中，采用TSR來“定量”觀察間質。所有HGIN及高分化腺癌者的TSR均≥1，34例TSR＜1者均為浸潤深度＞pT2，分化程度為中分化-低分化且合并淋巴結轉移者；這表明間質成分的增加對腫瘤的侵襲、轉移能力起著顯著促進的作用。本研究中發現，TSR≥1者的生存時間明顯高于TSR＜1者（P＜0.001），且TSR＜1是預后不良及合并淋巴結轉移的風險因素。由此推斷，該指標在預測患者結直腸癌預后及淋巴結轉移起到重要的作用。

TB通常被認為是腫瘤細胞活動及開始發生轉移的一個標志[11]。近年來的研究表明，出芽過程也是一個腫瘤細胞侵襲性與間質EMT過程共同作用導致的綜合結果。出芽位于腫瘤的侵襲前沿，此處也是癌細胞與CAFs發生交互作用的場所；WANG等[12]的研究表明，間質細胞產生的生長信號導致了局部的TB表型。由此認為，TB可作為一個輔助反映腫瘤浸潤前端的間質特性的指標，且與癌細胞的浸潤和轉移相關。MEYER等[13]在研究中發現，結直腸癌出芽細胞中，部分細胞出現CK＋/VIM＋雙陽性。預示出芽的細胞有部分是同時顯示上皮及間質特征，部分或全部顯示上皮間質轉化特征。

2019版日本結直腸癌治療指南中將TB級數≥2作為預測結直腸癌早期淋巴結轉移風險的重要因子出現，建議當TB等級≥2級時追加外科手術治療。在本次研究中，114例TSR＞1的病例中，低級別出芽（1級）更多見為53例（91.38%）。TB級數≥2為影響患者預后的風險因素（P＜0.05），但將該因素納入淋巴結轉移的多因素Logistics回歸分析后，差異無統計學意義；考慮可能與本研究中選取的進展期結直腸癌樣本數量多于早期結直腸癌樣本數量有關。

既往關于結直腸癌浸潤前端CAFs形態觀察與腫瘤腺體富集區域DR成熟度的研究較少。本研究擬通過對腫瘤浸潤前端中央處的CAFs和ECM形態描述，進一步對TME在結直腸癌不同時期的成分及作用進行描述。根據相關文獻的研究，腫瘤浸潤前端CAFs為成熟型的患者通常預后較好[14-15]。本次研究發現，在16例早期結直腸癌（pT1N0M0）浸潤前端CAFs中，有15例為非成熟型。猜測這可能是因為腫瘤早期階段，癌性DR不明顯，CAFs活化不完全，EMC產生較少有關；無淋巴結轉移組的患者中，浸潤前端CAFs成熟型顯著增多，而且CAFs形態與TSR無明顯相關性；CAFs形態與其功能有關，浸潤前端非成熟型CAFs細胞與結直腸癌的浸潤性生長方式及更高的T分期有關，另外可能與腫瘤浸潤轉移有關。然而，不同的腫瘤浸潤前端CAFs形態與腫瘤腺體富集區域癌性DR成熟度的患者在生存分析中差異無統計學意義；此外腫瘤浸潤前端CAFs形態、腫瘤腺體富集區域癌性DR成熟度在生存分析中差異無統計學意義，COX風險比例回歸模型及Logistics回歸分析也指出該指標與預后及淋巴結轉移的關聯性不佳。分析認為可能與以下因素相關：（1）HE染色對于癌性DR區域于中的CAFs和ECM的區分能力有限；（2）腫瘤腺體中央的DR及此處的CAFs在腫瘤的浸潤、轉移的過程中與腫瘤浸潤前端的DR及CAFs可能作用不同；（3）CAFs也可能影響原發性腫瘤的ECM“順應性”，導致ECM中的細胞及膠原形態發生改變，使位于腫瘤浸潤前端與腫瘤腺體富集區域的ECM和CAFs功能不同[17]。后續擬通過免疫組織化學法的“雞尾酒染色”，如α-SMA/膠原蛋白染色嵌套FAP/Vimentin染色，來達到對于該部位癌性間質反應的區分，從而更好的評價TME中不同成分的間質（CAFs和DR）在不同時期、不同部位的生物學功能。

綜上所述，本次研究聚焦于結直腸腫瘤的癌性間質特征，從“定量-TSR”到“定性-癌浸潤前端的CAFs形態和出芽”，從腫瘤中央到浸潤前區，從結直腸腫瘤發生的不同階段對其間質病理特征進行了闡述，并將間質病理特征同預后及淋巴結轉移聯系起來，為預測結直腸癌預后及淋巴結轉移提供了新的理論依據。作為一個單中心的回顧性研究，本研究尚存在著一些缺陷：實驗方法僅選取HE染色指標，較為單一；此次研究中浸潤深度為pT1a的患者僅3例，pT1b僅13例，在病例的分組上也存在著選擇偏倚。在后續的研究中，可考慮聯合多中心、大樣本量及增加間質病理觀察的指標，進一步驗證間質病理特征在不同分期結直腸癌中的表達及作用。