免疫親和柱凈化柱后光化學衍生高效液相色譜-熒光檢測法同時測定制馬腎中4種黃曲霉毒素

孫艷杰 趙 磊 李正剛 王路宏

吉林省四平市食品藥品檢驗所，吉林 四平 136000

馬腎藥材標準收載在《吉林省中藥材標準》第二冊2019版[1]，為馬科動物成年馬EquuscaballusLinnaeus雄性的干燥陰莖及睪丸。制馬腎為馬腎經過滑石粉炒，祛除其腥味，便于保存和臨床應用[2]。黃曲霉素(aflatoxins，AF)屬真菌毒素，是黃曲霉和寄生曲霉產生的雙呋喃環類毒素的次級代謝產物，以AF B1、B2、G1、G2較常見。AF的強致癌性，特別是AFB1，其毒性比氰化物、砷化物和有機農藥等的毒性更大，已被世界衛生組織癌癥研究機構列為Ⅰ類致癌物質[3-7]。黃曲霉性喜濕熱，中藥材及飲片潮濕季節，保存不當，容易造成黃曲霉毒素污染，特別是含蛋白質，油脂類的動物類藥材更容易黃曲霉毒素超標。《中國藥典》2020版一部中有較多動物類藥材和飲片品種進行了AF的限量控制，如地龍、蜂房、土鱉蟲等[8-10]。經查閱文獻，未發現有關于馬腎相關真菌毒素的研究報道。為保證制馬腎的用藥安全，本次研究采用檢測靈敏度較高的免疫親和柱，柱后光化學衍生，高效液相色譜-熒光檢測法同時測定制馬腎中AF B1、B2、G1、G2的含量，并進行了方法考察研究，驗證測定方法的可靠性，為臨床用藥安全提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BT125D型電子天平(北京賽多利斯儀器天平有限公司)，Agilent LC 1260型高效液相色譜儀(配Agilent LC1260II型熒光檢測器，安捷倫科技有限公司)，KRC-25型光化學柱后衍生器(青島普瑞邦生物工程有限公司)，TDL-5-A型離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 試驗材料 黃曲霉混合對照品溶液(AF B1、B2、G1、G2標示濃度分別為(1.04 μg/mL、0.38 μg/mL、1.08 μg/mL、0.38 μg/mL，批號：610001-202006，中國食品藥品檢定研究院)。10批制馬腎來源于炮制中式樣品。免疫親和柱(青島普瑞邦生物工程有限公司)。甲醇和乙腈(Flsher Scientific，色譜純)，純化水為自制，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 黃曲霉混合對照品工作溶液的制備 精密量取黃曲霉混合對照品溶液0.5 mL，置10 mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，作為貯備溶液。精密量取貯備溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，即得黃曲霉混合對照品工作溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取供試品約15 g(剪碎)，精密稱定，置于均質瓶中，加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，12000 r/min高速攪拌2 min，4500 r/min離心5 min，精密量取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，4500 r/min離心10 min，精密量取續濾液10.0 mL，通過免疫親合柱，流速每分鐘3 mL，用水20 mL洗脫，洗脫液棄去，使空氣進入，將水擠出免疫親合柱，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，取續濾液，即得。

2.2 色譜條件及測定方法 采用Agilent ZORBAX SB-C18，5 μm，250 mm×4.6 mm；流動相為：甲醇-乙腈-水(40∶18∶42)；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；采用柱后光化學衍生法(254 nm)，以熒光檢測器檢測，激發波長λex = 360 nm，發射波長λex = 450 nm。分別精密吸取“2.1.1”項下黃曲霉混合對照品工作溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。另精密吸取“2.1.2”項下供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，從標準曲線上讀出供試品中AF B1、B2、G1、G2的量，進行計算。AF B1、B2、G1、G2的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且無雜質干擾峰。結果如圖1所示。

(A)黃曲霉混合對照品 (B)樣品

圖1 黃曲霉 B1、B2、G1、G2色譜圖

2.3 線性范圍和檢出限 分別精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以進樣量(ng)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果見表1。

表1 4種黃曲霉毒素的線性、檢出限

取不含黃曲霉的樣品 15 g，加入適當稀釋的黃曲霉混合對照品溶液，同供試品溶液制備、測定，以信噪比(S/N)為3作為4種黃曲霉毒素的檢出限(limit of detection，LOD)。結果見表1。

2.4 精密度考察 取黃曲霉混合對照品工作溶液20 μL，注入液相色譜儀，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，分別計算黃曲霉B1、B2、G1、G2峰面積的RSD(n=6)分別為1.15%、1.08%、1.07%、1.31%。結果表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗 取“2.6”項下供試品溶液，分別于0 h、4 h、8 h、16 h、18 h、24 h，按“2.2”色譜條件，進樣20 μL，記錄所測各組分峰面積，黃曲霉 B1、B2、G1、G2峰面積的RSD(n=6)分別為1.82%、2.01%、1.91%、1.93%，結果表明對照品溶液在24 h內穩定。

2.6 重復性試驗及回收率試驗 經考察10批制馬腎中均未檢出黃曲霉B1、B2、G1、G2，故本次實驗重復性在加樣回收的6個平行試驗的同時進行考察。取不含黃曲霉的供試品粉末約15 g，各6份，精密稱定，分別置于均質瓶中，精密加入黃曲霉混合對照品儲備液75 μL，按“2.1.2”項下操作，按“2.2”項下色譜條件測定，計算回收率。測定結果見表2。結果表明方法的重復性良好，準確度達到方法要求。

表2 回收率實驗結果

2.7 樣品測定 取10批次制馬腎樣品，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下條件進樣測定，結果均未檢出AF B1、B2、G1、G2。

3 討論

3.1 樣品提取方法考察 本實驗分別采用勻質法和超聲提取法進行了制馬腎樣品中黃曲毒素的提取處理，結果勻質提取法AF B1、B2、G1、G2平均回收率分別為96.1%、95.2%、93.8%、94.4%，超聲提取法AF B1、B2、G1、G2平均回收率分別為90.5%、89.1%、91.1%、90.6%。回收率勻質法優于超聲提取法。且樣品的提取采用勻質法，12000 r/min 高速攪拌2 min即可完成操作，而超聲提取法需要超聲30 min，提取效率較勻質法低。故本次采用勻質法進行制馬腎樣品中黃曲霉毒素的提取。

3.2 色譜條件的考察 以甲醇-乙腈-水(40∶18∶42)；流速為1.0 mL/min-1；柱溫為25 ℃為色譜條件，分別考察了Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、YMC-Hydrosphere-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，3個不同品牌的色譜柱的測定效果。結果，AF B1、B2、G1、G2的分離度均達到2.0以上，塔板數均高于8000，表明方法的適用性較好。

3.3 黃曲霉檢測方法選擇 黃曲霉毒素有多種檢測分析方法，包括酶聯免疫吸附法、高效液相色譜-熒光法、膠體金快速定量法、實時熒光PCR方法、高效液相色譜-串聯質譜法等[11-13]。其中高效液相色譜-熒光法檢測應用最為廣泛。在4種黃曲霉毒素中，AF B1和G1遇水熒光猝滅，需要先進行柱后衍生化，來提高AF B1和G1的熒光強度，增強其靈敏度。柱后衍生法有碘衍生法和光化學衍生法兩種。碘衍生化法需要配制碘飽和溶液，且衍生劑有一定的腐蝕作用，也會造成基線的漂移，設備成本高。而光化學衍生操作簡便、不需要衍生劑與衍生溫度，延長檢測器壽命，購置成本低，儀器配制簡單，并且可以通過開關光化學衍生器，AF B1和G1的信號響應值變化來鑒別AF B1和G1假陽性反應，適用性更好。

本研究進行了免疫親和柱凈化柱后光化學衍生高效液相色譜-熒光檢測法同時測定中藥飲片制馬腎中AF B1、B2、G1、G24種黃曲霉毒素含量，并進行了方法學各項指標驗證，均滿足分析測定的要求。由于本次僅收集了10個批次樣品，雖然均未檢測出黃曲霉毒素，但馬腎為動物類藥，蛋白質含量高，濕熱環境下非常容易感染黃曲霉毒素，存儲溫度控制不好，會存在非常大的安全風險，故對其進行AF的更多批次樣本和持續監控檢測仍然具有非常大的意義[14-16]。