產電細胞的合成生物學設計構建

趙貞堯，張保財，李鋒，宋浩

（1 天津大學化工學院，天津300072； 2 天津大學合成生物學前沿科學中心和系統生物工程教育部重點實驗室，天津300072）

引 言

隨著國民經濟的飛速發展，能源短缺和環境污染已成為我國工業現代化進程中的兩大難題，開發綠色環保可再生新能源的需求迫在眉睫。以電活性微生物為核心的生物電催化系統，特別是產電微生物構成的微生物燃料電池（microbial fuel cell，MFC）是潛在解決方案。MFC 借助產電微生物抽提、轉化蘊藏在有機物中的電子，并與外界環境中的電子受體（電極、金屬氧化物等）進行電子交換，實現化學能與電能間的能量轉化，在能源環境等諸多領域有著廣泛的應用[1-4]。

產電微生物在生態系統中分布廣泛，目前已經發現包括細菌、真菌和古菌在內的產電微生物有上百種，并且隨著篩菌技術的發展，越來越多的產電微生物被發現[5-6]。當前，希瓦氏菌（Shewanella）和地桿菌（Geobacter）作為模式產電菌，研究最為廣泛[7]。而自然環境中野生型產電微生物存在可利用底物譜窄、底物攝取代謝強度弱，胞內電子池容量小、胞內還原力再生效率差，胞外電子傳遞速率慢、電子通量小，且其所構成的微生物電催化系統穩定性差，難以適應復雜的環境等問題，這已成為限制其工業化應用的主要瓶頸[8]。

近年來，隨著研究的不斷深入，從基因分子水平理解產電微生物的代謝生理、電生理機制已成為現實。同時伴隨著合成生物學、基因編輯技術的迅猛發展，以及從頭設計合成、多模塊組合適配等工程化策略的引入，產電微生物的能量轉化效率得到大幅提升。本文基于產電微生物介導化學能到電能的能量轉化路徑，以模式產電菌Shewanella 和Geobacter 為主體，總結闡明了產電微生物的電子胞內生成過程與胞外傳遞機制。系統綜述了近五年國內外利用合成生物學增強產電微生物底物攝取利用、強化胞內電子生成、加速胞外電子傳遞方面的研究進展（圖1），并對未來設計構建高效產電細胞的研究進行了展望。

1 產電微生物的胞內電子生成與胞外電子傳遞機制

1.1 產電微生物的胞內電子生成

產電微生物作為微生物燃料電池系統的催化核心，通常以環境中的有機物（如甲酸、乙酸、乳酸、葡萄糖等）作為電子供體。有機底物經過產電微生物的中心碳代謝，將電子傳遞給胞內NAD+、FAD 形成胞內還原力NADH、FADH2，或存儲在丙酮酸、甲酸等中間代謝物中，這些胞內還原力和富含電子的中間代謝物共同構成了產電微生物的胞內可釋放電子池。隨后，在NADH 脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、甲酸脫氫酶等酶催化下，胞內電子載體攜帶的電子匯入位于細胞內膜的醌池中，位于醌池中的電子經過甲基萘醌脫氫酶釋放，實現電子的胞內生成，并最終通過胞外電子傳遞系統傳遞到胞外電子受體[9-11]。

圖1 產電細胞電子生成和傳遞Fig.1 Electron generation and transfer of exoelectrogens

NADH 是產電微生物胞內主要的電子存在形式，負載了絕大部分來自底物的電子，在NADH 脫氫酶的催化下，電子實現從NADH 到內膜醌池的匯集轉化。因此，產電微生物NADH 脫氫酶催化的效率直接影響了產電微生物胞內電子的生成效率。目前共發現三類NADH 脫氫酶[9,12]：①Na+跨膜移位的 NADH 脫 氫 酶（Na+-translocating NADH dehydrogenase,NQR），在NQR 催化的NADH 氧化過程中，伴隨Na+的跨膜運輸，產生膜兩側的離子梯度勢，從而對酶催化反應產生反饋抑制作用[13]。②H+跨膜移位的Ⅰ型NADH 脫氫酶（H+-pumping type ⅠNADH dehydrogenase, NDH Ⅰ），NDH Ⅰ催化的NADH 氧化，伴隨著H+的跨膜運輸，從而產生膜兩側的質子動力勢。一方面，膜兩側的質子動力勢驅動了ATP合酶加速合成ATP；另一方面，較大的質子動力勢又反饋抑制了NDH Ⅰ催化的NADH 氧化反應，不利于電子從NADH 到內膜醌池的傳遞。③無質子跨膜的Ⅱ型NADH 脫氫酶（non-protonpumping type ⅡNADH dehydrogenase, NDH Ⅱ），由于NDH Ⅱ催化過程中不存在H+的跨膜轉運，這使得NADH 的氧化反應不受高離子梯度勢或質子動力勢的反饋抑制，另外NDH Ⅱ僅由一條肽鏈組成，蛋白分子大小僅為上兩類脫氫酶的1/10，極大降低了細胞的生理、代謝負荷。在大多數產電微生物中，三類NADH 脫氫酶均有分布，共同催化電子從NADH到內膜醌池的轉化。

1.2 產電微生物的胞外電子傳遞

通常認為電子從細胞（內）膜到胞外電子受體（電極、金屬氧化物等）的傳遞過程為產電細胞的胞外電子傳遞（extracellular electron transfer, EET）[5]。來自醌池的電子通過細胞表面導電元件，跨越絕緣的細胞外結構（細胞膜、細胞壁），通過直接或間接的方式傳遞到胞外電子受體。目前，兩種胞外電子傳遞機制得到廣泛認可。

（1）基于細胞色素蛋白或導電納米線介導的直接電子傳遞：c 型細胞色素蛋白是產電微生物表面的主要導電元件，在絕大部分產電微生物中均有分布。這些色素蛋白中含有多個血紅素，利用鐵原子氧化態與還原態之間的可逆反應介導電子傳遞。目前已發現數百種色素蛋白，但對其分子機制的研究主要集中在模式產電菌奧達奈希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）的金屬還原途徑（MtrCAB）和硫還原地桿菌（Geobacter sulfurreducens）的Pcc 途徑[14]。在MtrCAB 途徑中，位于細胞內膜的甲萘酚脫氫酶CymA 將匯入醌池的電子傳遞到周質色素蛋白FccA、STC 等，隨后通過外膜MtrCAB 色素蛋白多聚體傳遞到胞外[15]。最新研究顯示，外膜MtrCAB 色素蛋白多聚體由周質色素蛋白MtrA、跨膜孔蛋白MtrB和外膜色素蛋白MtrC組成。MtrA、MtrC是含有多個血紅素的c 型色素蛋白，MtrB 是細胞外膜上由26 股反向平行的β 鏈組成的疏水性桶狀孔蛋白，連接了外膜兩側的色素蛋白，將嵌入內側的含有血紅素的MtrA 與外環境隔離，形成自然絕緣的“分子電線”可有效防止氧氣等外源分子掠奪膜內電子[16]。G.sulfurreducens 的Pcc 路徑與MtrCAB 相似，包含了內膜色素ImcH 和CbcL、周質空間色素PpcA-E 以及外膜色素蛋白OmaB、OmaC、OmcB 及OmcC 等[17-21]。不同的是，Geobacter的色素蛋白更豐富，并含有多個同源物，這使其具有多條“膜電子通道”，因此，G.sulfurreducens相比S.oneidensis具有更大的跨膜電子通量。

除了細胞色素蛋白，產電微生物還可以利用細胞表面長達數十微米的菌毛，即“導電納米線（e-Pili）”介導電子的遠距離傳導[22-25]。當前，對產電微生物“導電納米線”介導胞外電子傳遞的研究主要集中在G.sulfurreducens 的IV 導電菌毛Pili 上，e-Pili由菌毛蛋白PilA 單體組裝而成，富含芳香氨基酸[26-29]。目前關于電子在e-Pili 中的傳遞機制仍有爭論。Malvankar 等[30]認為e-Pili 芳香氨基酸殘基的π-π 鍵軌道相互重疊，電子在電子云中自由穿梭，以離域的形式沿著菌毛傳遞；而另一種觀點認為電子并非以自由穿梭的形式沿e-Pili 傳遞，而是借助e-Pili 中的芳香氨基酸或色素蛋白（OmcS 等），以電子跳躍的形式傳遞[31]。

（2）基于可溶性氧化還原活性分子介導的間接電子傳遞：除上述基于細胞色素蛋白或導電納米線介導的直接電子傳遞外，產電微生物還可利用自身分泌的或環境中存在的可溶性氧化還原活性分子（黃素類[32-33]、吩嗪類[34]、醌類[35-36]）以及細胞代謝中間物（甲酸、氫氣）間接介導電子傳遞。目前，針對可溶性氧化還原活性分子介導產電微生物間接電子傳遞機制的研究，主要集中在黃素類化合物介導S. oneidensis 間接電子傳遞上。最初認為這些氧化還原活性分子，以游離形式穿梭于產電菌和電子受體之間，通過“雙電子氧化還原反應”介導產電微生物的電子傳遞[33]。但近期研究發現，一些小分子化合物（如黃素類物質）還可以作為外膜色素蛋白的輔因子，與外膜導電色素蛋白結合在一起形成半醌等物質，以“單電子氧化還原反應”方式加快基于導電色素蛋白的單電子傳遞過程，其電子傳遞速率是色素蛋白直接接觸導電速 率 的103～105倍[37-40]。Breuer 等[41-42]進 一 步 研 究了Shewanella 外膜色素蛋白與黃素類化合物的作用關系，發現色素蛋白與黃素的結合是一個可逆過程，色素蛋白中高保守CX8C 模體中的半胱氨酸巰基氧化形成的二硫鍵是調控黃素分子與色素蛋白綁定結合的核心部位，這一核心區域受到外界環境的直接影響。在厭氧環境中，二硫鍵處于還原狀態，加速黃素分子與色素蛋白的結合，進而形成單電子介導機制；而在有氧條件下，氧化態的二硫鍵不利于黃素分子與色素蛋白結合，導致黃素分子-色素蛋白復合物分離，黃素類分子以雙電子機制介導電子傳遞。此外，部分產電微生物還可通過分泌c-型色素蛋白，并以其作為電子傳遞載體介導間接電子傳遞[41-42]，如Geobacter 可通過分泌色素蛋白pgcA，在缺少導電納米線情況下還原不溶性鐵氧化物，但這些分泌型色素蛋白類電子傳遞載體往往具有電子受體特異性，只能將電子傳遞到金屬氧化物等特定電子受體中[43]。

2 產電微生物能量轉化效率的合成生物學強化

2.1 產電微生物底物攝取范圍與攝取速率的合成生物學強化

自然環境中野生型產電微生物受限于底物轉運蛋白和胞內相關代謝酶缺乏，致使底物攝取范圍窄、代謝速率緩慢，嚴重限制了產電微生物的電子生成和傳遞效率[44-45]。近年來，研究人員分別采用自適應性進化策略和合成生物學理性設計方法，拓寬了產電微生物的底物攝取范圍，提高了底物攝取速率，同時按照“勞力分工”原則構建了混合產電微生物菌群，進一步提高了以產電微生物為核心的微生物燃料電池的能量轉化效率。

圖2 產電菌的底物攝取范圍拓寬(a)構建代謝木糖產電的工程希瓦氏菌[47];(b)構建希瓦氏菌-肺炎克雷伯氏菌合成菌群產電[55];(c)構建釀酒酵母菌-希瓦氏菌合成菌群產電[56];(d)構建藍藻-希瓦氏菌合成菌群產電[57]Fig.2 Extension of substrate scope of electrogenic bacteria(a)construction of S.oneidensis for metabolizing xylose[47];(b)synthetic Klebsiella pneumoniae-Shewanella oneidensis consortium for power generation[55];(c)synthetic S.cerevisiae-S.oneidensis consortium for power generation[56];(d)synthetic S.cyanobacteria-S.oneidensis consortium for power generation[57]

2.1.1 拓寬底物攝取范圍 以模式產電菌Shewanella 為代表的產電微生物可利用底物譜窄，僅可以利用甲酸、乳酸等有機酸作為電子供體產電。為增強產電微生物對葡萄糖、木糖、甘油等廉價、易得、分布廣泛底物的利用效率，Sekar 等[46]采用適應性進化和定向篩選策略，激活了Shewanella MR-1 的木糖代謝途徑，使之能夠代謝木糖生長。相比于適應性進化，合成生物學理性設計在拓寬底物譜的同時提高了底物的攝取速率。Li等[47]將假絲酵母（Candida intermedia）和丙酮丁醇梭桿菌（Clostridium acetobutylicum）的木糖轉運蛋白，大腸桿菌（Escherichia coli）的異構酶途徑以及裂殖酵母（Schefersomyces stipites）的氧化還原酶途徑在S.oneidensis MR-1 中異源表達，構建了木糖攝取代謝路徑，使其可以將木糖作為電子供體放電，進一步提高了產電微生物的底物利用效率[圖2（a）]。

葡萄糖作為最常見的工業發酵底物，單摩爾電子含量要遠高于乳酸。通過對Shewanella 的基因序列比對分析發現，其自身具有代謝葡萄糖的Entner-Doudoroff 途徑，這表明Shewanella 具有利用葡萄糖產電的潛力。針對這一現象，Howard 等[48]在僅含有葡萄糖的最小培養基中篩選了具備代謝葡萄糖能力的Shewanella，這證明Shewanella 的確具有利用葡萄糖為單一碳源的能力。此外，Choi 等[49]將運動發酵單胞菌（Zymomonas mobilis）的葡萄糖轉運基因（glf）和葡萄糖激酶基因（glk）在S. oneidensis MR-1中進行異源表達，經過改造后的S. oneidensis MR-1能夠利用葡萄糖作為單一碳源生長，同時也可以葡萄糖作為電子供體。因此，通過適應性進化策略與合成生物學理性設計方法可不斷拓寬產電微生物可用底物譜，對擴展產電微生物的應用范圍具有重要意義。

2.1.2 強化底物轉化速率 在拓寬產電微生物的底物利用譜范圍的同時，提高產電細胞的底物攝取速率可進一步強化產電微生物的代謝速率與代謝通量，從而增強產電微生物電子的胞內生成。為此，Johnson 等[50]在S.oneidensis MR-1 中表達了光驅動質子泵視紫紅質，光照條件下，質子泵視紫紅質將質子逆濃度梯度跨膜轉運，從而在細胞膜兩側產生更大的質子動力勢，提高了底物乳酸的攝取速率，最終增強了S.oneidensi 的電子傳遞速率。除了通過合成生物學理性改造產電微生物外，通過人工干預改變產電微生物的電化學環境或外源添加化學物質改變細胞膜通透性也可以提高底物轉化速率，Matsuda 等[51]證明Shewanella 中TCA 循環活性受到電化學的精確門控，這使得改變陽極電位以提速Shewanella 的物質代謝速率成為可能。Wang 等[52]發現向微生物燃料電池中添加乙二胺四乙酸(EDTA)，可顯著提高微生物燃料電池的功率密度，進一步研究發現，EDTA 不僅能夠改善S. oneidensis MR-1 的外膜通道環境，還能上調S.oneidensi 的TCA 循環相關基因的表達水平，進一步增強了其TCA 循環的代謝強度，從而拉動、提升了底物攝取與轉化速率。此外，Wen 等[53]用表面活性劑鼠李糖脂處理細胞，發現鼠李糖脂能夠顯著加強產電菌自身酶活從而促進菌體生長，同時降低細胞膜的電子傳遞阻力，提升了電子傳遞速率。通過增強細胞邊界膜結構的通透性，可顯著提高底物的攝取、代謝速率，降低電子傳遞的阻力。

2.1.3 構建混菌生態系統 針對單種產電微生物的底物改造往往會增加產電菌的代謝負荷，難以大幅提高產電菌的電子傳遞速率與能量轉化效率。通過構建人工混菌系統，調配多菌間相互作用，實現菌株間代謝耦合適配，增強混菌產電體系利用廉價工業發酵底物和復雜混合物系統的產電能力，從而徹底解除Shewanella、Geobacter 等模式產電菌的底物限制。Li 等[54-55]構建了肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）和S. oneidensis MR-1 的兩菌混菌產電體系，K.pneumoniae以葡萄糖、木糖或甘油作為底物高產乳酸供給S.oneidensis 產電，該系統可通過降解玉米秸稈水解液高效產電，實現農牧廢物向清潔電能的轉化[圖2（b）]；Lin 等[56]以葡萄糖作為底物，將釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和S.oneidensis MR-1 混合培養，通過合成生物學改造強化了S. cerevisiae 的乳酸生產能力，并增強S.oneidensis MR-1細胞膜通透性、導電性，使得混菌產電系統的功率密度大幅提升[圖2（c）]；Zhu 等[57]構建了新型的微生物光伏系統，光合藍細菌（Synechococcus elongatus）在光照下將二氧化碳轉化為乳酸供給S.oneidensis MR-1 產電，通過培養過程優化使得產電系統可以持續工作超過40 d[圖2（d）]。因此，建立代謝耦合的人工菌群產電系統能夠顯著強化MFC 的底物攝取范圍以及攝取能力，實現復雜底物向電能的轉化。

2.2 產電微生物胞內電子生成的合成生物學強化

野生型產電微生物往往面臨胞內電子池容量小，胞內還原力再生速率差以及胞內還原力-電子轉化效率低等問題，這嚴重限制了產電細胞的電子輸出通量和胞外電子傳遞速率。為此，研究人員利用合成生物學理性設計方法和多模塊組合工程策略，強化胞內還原力再生，提高了胞內NADH/NAD+比例和總量。使得胞內可釋放電子池得到拓寬，加快胞內還原力到可釋放電子的轉化，強化了產電微生物的胞內電子生成。

2.2.1 強化胞內還原力再生 胞內還原力再生水平與可釋放電子池容量(NADH/NAD+比例及總量）直接決定了產電細胞的可釋放電子水平。通過加快中心碳代謝、抑制胞內還原力消耗路徑（如乳酸合成代謝）、過表達NAD+合成酶基因等手段可顯著提高產電微生物的胞內電子池容量。在厭氧條件下，微生物通過合成富含電子的中間產物（如丙酮酸等）以維持自身胞內氧化還原平衡。然而，這使得胞內電子發生流失，為此，Yong 等[58]在E.coli中通過敲除乳酸脫氫酶基因ldhA，在厭氧條件下抑制了丙酮酸向乳酸的轉化，從而提升胞內NADH/NAD+的比例和總量，提高了細胞與電極之間的電子傳遞速率[圖3（a）]。在厭氧條件下，微生物中心碳代謝受到多重調控系統的嚴密調控，導致TCA 循環強度下降，源自電子供體的電子大多儲存在乙醇、甲酸、乙酸等中間代謝物中，難以釋放到胞外。針對這一問題，Liu等[59]通過敲除E.coli雙組分調控系統Arc中的arcA 基因，提高了TCA 循環的代謝強度，增強了厭氧條件下E.coli 呼吸能力，最終提升其電催化效率和電流輸出能力[圖3（b）]。

圖3 產電菌胞內電子生成和傳遞的強化(a)敲除ldhA以擴充大腸桿菌可釋放電子池[58];(b)敲除arcA以擴充大腸桿菌可釋放電子池[59];(c)模塊化強化NADH再生路徑以強化希瓦氏菌胞內還原力再生[60];(d)改造希瓦氏菌從頭合成NAD+以強化希瓦氏菌胞內還原力再生[61]Fig.3 Generation and transform of intracellular electronics in electrogenic bacteria(a)knockdown ldhA in E.coli for augmenting intracellular electron pool[58];(b)knockdown arcA in E.coli for augmenting intracellular electron pool[59];(c)modular engineering regeneration pathway of NADH in S.oneidensis for intracellular reducing power regeneration[60];(d)engineering de novo biosynthesis of NAD(H/+)in S.oneidensis for intracellular reducing power regeneration[61]

相比于E.coli，Shewanella 作為模式產電微生物更具備電子池擴容潛力。近年來，通過從頭設計合成、多模塊組合工程策略強化，研究人員拓寬Shewanella 的胞內還原力再生與可釋放電子池，顯著提高了微生物燃料電池的輸出功率。Li等[60]利用合成生物學模塊化策略和代謝工程方法，對S.oneidensis MR-1中心碳代謝中所有氧化還原路徑進行了系統分析。從糖酵解路徑、C1 代謝路徑、丙酮酸發酵代謝路徑和TCA 循環四個模塊中挖掘到4個顯著增強NADH 再生的基因并進行模塊化組合表達，將NADH/NAD+比例提高4.3倍，使得代謝流更多地流向NADH 再生方向，強化了胞內還原力再生[圖3（c）]。此外，Li 等[61]重構了S. oneidensis MR-1 內的NAD+的生物合成路徑，通過合成生物學模塊化手段解耦、組合NAD+從頭合成途徑、補救合成途徑和通用合成路徑，成功將胞內NAD（H/+）總量提高2.1倍，并將其胞外電子傳遞速率提升4.4 倍，揭示了產電微生物的胞內還原力NAD（H/+）總量是限制其胞外電子傳遞速率的核心瓶頸之一[圖3（d）]。

2.2.2 提高胞內還原力-電子轉化效率 儲存在胞內NADH 中的電子在NADH 脫氫酶的作用下，匯入醌池，實現胞內還原力到電子的轉化。針對野生型產電微生物NADH 脫氫酶催化效率低限制胞內還原力-電子轉化效率這一瓶頸問題，通過設計優化NADH 脫氫酶，可以顯著增強NADH 的電子釋放，增強產電微生物胞內還原力-電子的轉化效率。Vamshi 等[62]在E.coli 中異源表達來自枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的NAD Ⅱ，工程改造后的E.coli 電流輸出能力提升了9 倍，同時促進了電極表面生物膜的形成，極大降低了其電荷轉移阻力。另外，Shewanella loihica PV-4 中的NAD II 具有較強的催化活性，在模式產電菌S.oneidensis MR-1 中異源表達源自Shewanella loihica PV-4 的NAD Ⅱ，極大地強化了S.oneidensis MR-1 的還原力-電子的轉化速率[63]。因此，通過優化改造NADH 脫氫酶，促進胞內還原力到電子的轉化，可以加快胞內電子匯入內膜醌池，從而擴充內膜電子通量。

2.3 產電微生物的胞外電子傳遞的合成生物學強化

產電微生物胞外電子傳遞速率低是限制微生物電催化系統工業化廣泛應用的重要瓶頸[64]，針對這一關鍵科學問題，近年來，研究人員基于產電微生物直接電子傳遞和間接電子傳遞機制，將合成生物學理性設計與多模塊組合適配工程策略融入設計中。通過優化產電微生物色素蛋白系統、強化導電納米線介導的遠距離電子傳遞、構建電活性生物膜以及強化電子傳遞載體的合成傳遞，顯著提高了產電微生物的胞外電子傳遞速率。

2.3.1 優化細胞色素蛋白系統 細胞色素蛋白是電子跨越絕緣細胞膜的高速通道，連接了胞內電子生成系統與胞外電子傳遞系統，同時也是直接電子傳遞和間接電子傳遞兩種電子傳遞機制的交匯點[14]。設計、優化產電微生物的細胞色素蛋白系統對提高其胞外電子傳遞速率具有重要意義。Ajo-Franklin等[65-68]在非電活性微生物E.coli中從頭設計構建了導電色素蛋白系統，他們將S.oneidensis MR-1 的CymA、MtrCAB 關鍵導電色素蛋白引入E. coli，在E.coli 建立了一套新的電子傳遞通道，最終顯著提高了E.coli對金屬離子和金屬氧化物的還原速率[圖4（a）]；此外，Sekar等[69]將Geobacter 的外膜色素蛋白OmcS 引入藍藻（Synechococcus elongatus PCC 7942），外膜色素蛋白的引入顯著地提升了S.elongatus 的胞外電子傳遞速率，使得生物光電池的光電子生成能力提升了9倍。

相較于非電活性微生物，電活性微生物本源的色素蛋白系統需要進一步理性設計和工程改造。通過完善周質電子傳遞鏈、消除周質空間耗電子反應、提升外膜導電蛋白數量等策略改善基于色素蛋白系統的電子傳遞速率。位于S.oneidensis MR-1細胞內膜的CymA 是連接醌池和外膜氧化還原蛋白（MtrA、OmcA 和OmcB）之間的重要電子傳遞通道，Vellingiri 等[70]通過過表達S. oneidensis MR-1 中的cymA 基因強化了微生物燃料電池的產電性能[圖4（b）]；Delgado 等[71]認為S.oneidensis 周質空間雜亂的電子傳遞環境可能導致部分電子無法傳遞到MtrABC復合物，從而不能最大化胞內電子輸出。隨后，他們為了消除部分周質空間電子競爭并提升電子向外傳遞速率，將部分起到電子爭奪作用的基因替換為血紅素合成基因cctA，將S. oneidensis 的cctA表達強度上調3.7 倍，最終使得檸檬酸鐵的還原率提升了1.7 倍，所輸出電流密度提升了23%。Min等[72]將黃素生物合成基因簇ribD-ribC-ribBA-ribE和胞外氧化還原蛋白mtrC-mtrA-mtrB 在S.oneidensis MR-1 中共同表達，最大電流密度分別增加了約110%和87%，顯著地增強基于兩種電子傳遞機制的電子傳遞速率[圖4（c）]。以上研究結果證明，采用合成生物學方法優化介導電子傳遞過程的細胞色素蛋白將顯著提高產電微生物的胞外電子傳遞能力。

圖4 強化導電元件提升電活性微生物產電能力(a)異源表達mtrCAB的大腸桿菌用于還原可溶性金屬氧化物[68];(b)過表達cymA加強希瓦氏菌的胞外電子傳遞[70];(c)共表達mtrC-mtrA-mtrB和ribD-ribC-ribBA-ribE 增強希瓦氏菌的胞外電子傳遞[72]Fig.4 Strengthen the conductive components for enhanceing the electricity generation capacity of electroactive microorganisms(a)overexpressing mtrCAB in E.coli for reducing soluble metal oxide[68];(b)overexpressing cymA in S.oneidensis for enhancing extracellular electron transfer[70];(c)coexpression of mtrC-mtrA-mtrB and ribD-ribC-ribBA-ribE in S.oneidensis for enhanceing extracellular electron transfer[72]

2.3.2 強化導電納米線介導的遠距離電子傳遞 產電微生物細胞表面長達數十微米的導電納米線由于其超高的電導率，在電子的長距離傳遞中展現出獨特的優勢。然而，目前僅有G.sulfurreducens 等少數產電菌具有導電納米線，通過對不具備導電性的菌毛單體蛋白結構進行編碼重構，可顯著提高產電細胞菌毛的電導率。Liu等[73]在敲除P.aeruginosa的菌毛單體蛋白pilA*的同時，異源表達來自G.sulfurreducens的菌毛蛋白基因pilA，成功組裝出電導率與G. sulfurreducens 相當的e-Pili。通過比對多株產電菌菌毛單體蛋白PilA 的氨基酸序列，發現菌毛單體蛋白PilA 的N 端序列呈現高度保守的α-螺旋。相比于其他菌株，G. sulfurreducens 的菌毛蛋白PilA僅有N 端保守區的61 個氨基酸。隨后，他們將P.aeruginosa 的PilA*截斷，表達僅含N 端61 個氨基酸的PilA*1～61，發現敲除pilA*的P.aeruginosa 能夠形成e-Pili，電子傳遞速率顯著提高，由此推測菌毛蛋白PilA 的N 端保守α-螺旋可能是導電Pili 的核心結構。此外，在G. sulfurreducens 的菌毛單體蛋白PilA的C 末端融合功能短肽（組氨標簽等），在保持產電細胞Pili 高電導率的同時使其具有特異性吸附、識別功能，可進一步拓寬產電微生物在生物傳感器、環境修復等領域的應用。

進一步研究發現，導電納米導線的電導率與菌毛單體蛋白PilA 中的芳香氨基酸密切相關。通過將G.sulfurreducens中PilA 蛋白C 端的苯丙氨酸和酪氨酸替換為電子云密度更高的色氨酸，G.sulfurreducens 的pili 直徑縮減至1.5 nm，僅為原來的一半，而所形成的e-Pili 電導率增加了2000 倍[29]。Tan 等[27]在G.sulfurreducens 中異源表達金屬還原地桿菌（G.metallireducens）的菌毛蛋白，發現產生了更多的e-Pili，并且電導率提高5000 倍。相比于G.sulfurreducens，G. metallireducens 的菌毛單體蛋白C端的芳香氨基酸密度更高。因此其導電納米線具有更高的電導率，電子傳遞阻力更小，這為產電微生物設計合成高電導率的納米導線提供了理論依據。

圖5 強化導電生物膜提升微生物電活性(a)構建近紅外光響應性大腸桿菌生物膜系統催化吲哚轉化為色氨酸[80];(b)在MFC中構建基于近紅外光響應的c-di-GMP邏輯門[81]Fig.5 Strengthen the conductive biofilm to improve the electrical activity of microorganisms(a)construction of NIR-light-responsive E.coli biofilm system for catalyzing indole into tryptophan[80];(b)construction of NIR light responsive c-di-GMP logic gate in MFC[81]

2.3.3 構建電活性生物膜 產電微生物常以多細胞形式與電極直接接觸導電，微生物及其分泌的蛋白質、多糖、脂質、DNA 等胞外聚合物共同構成導電生物膜。電極生物被膜通過導電納米線、色素蛋白及其復合物介導胞外電子傳遞，速率遠高于浮游細胞利用氧化還原活性分子介導的電子傳遞。其中，Geobacter 的陽極生物膜厚度可以達到50 μm，同時電子傳遞速率隨其生物膜增厚而提高[74-76]。然而，野生型產電微生物的生物被膜厚度薄、細胞數量少、內部傳質效率低、導電性差、難以適應復雜的應用環境。因此，通過合成生物學手段提升生物膜機械強度、導電性能，構建成熟、穩定的導電生物膜將進一步提高電活性微生物的胞外電子傳遞速率。

環二鳥苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP）是胞內第二信使信號分子，通過調節胞外多糖產生、表面黏附素表達、生物膜消散等細胞行為控制細菌的生物膜的形成[77]。在G.sulfurreducens 中存在一類受c-di-GMP 調控的PilZ 蛋白域，Leang 等[78]敲除含有PilZ 蛋白域的基因GSU1240，發現工程菌的生物膜厚度比野生型提升了6 倍，電極表面形成更加致密的導電生物膜，并成功將功率密度提升70%。Liu等[79]分別構建了IPTG 誘導型啟動子和組成型啟動子開啟表達c-di-GMP 生物合成基因ydeH 的S.oneidensis MR-1，經過工程改造的S. oneidensis MR-1 最大功率密度可以達到野生型的2.8 倍，強化cdi-GMP 合成的工程菌幾乎完全覆蓋電極表面，極大地強化了S. oneidensis MR-1 的直接電子傳遞過程；Hu 等[80-81]利用光敏色素c-di-GMP 合成基因bphS 和發光色團合成基因bphO 構建了光控合成生物膜的微生物，體系中存在IPTG 時，近紅外光開啟c-di-GMP生產進而強化生物膜形成，促進胞外電子傳遞，強化電流輸出能力和目標產物的合成（圖5）。以上研究結果表明，c-di-GMP參與產電微生物的電極生物膜形成過程，通過調控c-di-GMP 的合成將強化產電微生物的電極附著量以及附著面積，顯著提升基于生物膜直接電子傳遞機制介導的胞外電子傳遞速率。

細 胞 外 聚 合 物（extracellular polymeric substances，EPS）是位于細胞外周，由多糖、蛋白質和核酸等物質構成的，具有較強的結構內聚力和黏附性的復合物[82]，可以促使產電微生物在電極表面更好地形成生物膜。加快EPS 的合成、減緩EPS 的降解有助于生物膜更好地定植在電極表面，Ding 等[83]認為腐胺可能與EPS 的分解直接相關，通過構建轉座子文庫，篩選到腐胺合成缺陷型菌株。進一步研究發現，該突變株生物膜中EPS 的含量得到大幅提升，并強化了對鉻的還原能力。通過調控電活性微生物EPS成分構成，使生物膜獲得更強的附著能力，提高電極表面的生物附著量。Kouzuma 等[84]發現通過敲除S.oneidensis MR-1中與多糖莢膜合成相關的基因SO3177可以增強其細胞表面的疏水性，強化在石墨電極表面的定植效果，最終使得MFC 的產電提高了50%；Godeke 等[85]認為胞外核酸（extracellular DNA，e-DNA）與生物膜的形成直接相關，通過敲除細胞外核酶編碼的基因exeM 從而降低e-DNA 的降解能力，顯著提升了生物膜的厚度。上述研究結果表明，工程改造產電細胞的EPS，對提高生物膜黏附性、增加產電微生物的電極表面生物量、提高微生物與電極表面電子傳遞速率具有重要意義。

群體感應（quorum sensing，QS）系統通過調控參與黏附的膜外蛋白、引導群體遷徙行為、刺激EPS分泌、促進菌落形態變化等方式控制生物被膜的形成。在厭氧條件下，P. aeruginosa 中吩嗪類化合物的合成量受到2-庚基-3,4-二羥基喹啉（2-heptyl-3,4-dihydroxyquinoline，PQS）信號分子的抑制，Wang等[86]通過合成生物學手段降低厭氧條件下P.aeruginosa 中PQS 濃度，使其吩嗪合成能力顯著增強，最終將微生物燃料電池的最大電流密度提升了5 倍。分析伏安特性曲線發現綠膿菌素參與了電極生物膜的氧化還原反應，這表明QS系統通過控制吩嗪等小分子化合物的分泌，從而強化了電極生物膜導電能力。Chen 等[87]研究了群體感應信號分子酰基高絲氨酸內酯（acyl homoserine lactones,AHLs）對產電菌電活性的影響。借助混菌體系分析內、外源的AHLs 分子對菌群產電影響，發現AHLs 使混菌MFC 系統中微生物的電化學活性、電極生物量、生物膜致密性、活/死細胞比、EPS 成分多樣性以及氧化還原性都得到提升，同時發現外源添加的AHLs會使Geobacter 的豐度從56%提升至71%～78%；隨后，他們[88]進一步研究了AHLs 對Geobacter soli GSS01的影響，發現Geobacter soli GSS01本身分泌的內源性AHLs 可以促進生物膜的形成并強化電活性，而外源性的AHLs 則會進一步增強這些過程。因此，利用QS系統強化電活性微生物的電極生物膜附著、提高生物膜中的電子傳遞載體濃度對提高微生物燃料電池的產電性能具有積極意義。

2.3.4 強化電子傳遞載體生成 可溶性氧化還原活性分子（黃素類、吩嗪類、醌類等）介導的產電微生物間接電子傳遞是大部分產電微生物主要的胞外電子傳遞方式。然而，野生型產電微生物電子傳遞載體的合成、傳遞能力有限。為此，研究人員通過合成生物學方法強化電子傳遞載體的合成傳遞，同時按照勞力分工原則，利用人工混菌系統強化微生物電催化體系的電子傳遞載體供給，將產電微生物胞外電子傳遞速率提高數十倍。針對模式產電菌S. oneidensis 因黃素合成能力不足而限制其胞外電子傳遞速率的問題，Yang 等[89]將B.subtilis 中編碼核黃素合成相關酶的核心基因簇ribADEHC 在S.oneidensis MR-1 中異源表達，將核黃素產量提高到26.15 μmol/L，S.oneidensis MR-1 雙向電子傳遞速率分別提高13.2 倍（放電）和15.5 倍（噬電）[圖6（a）]；在此基礎上，Lin 等[90]進一步將ribADEHC 基因簇和P. aeruginosa PAO1 孔蛋白基因oprF 在S. oneidensis MR-1 中組合表達，同時強化了核黃素合成和傳遞能力，使核黃素的產量提高至39.7 μmol/L，電子傳遞效率提高12倍[圖6（b）]。這進一步證明強化黃素生產對S.oneidensis MR-1胞外電子傳遞效率的提升具有重大意義。

圖6 強化電子傳遞載體提升電活性微生物產電能力(a)構建黃素生物合成途徑以強化希瓦氏菌胞外電子傳遞[89];(b)構建核黃素-自組裝三維rGO雜化生物膜以強化MFC的電流輸出能力[90]Fig.6 Strengthen the electron shuttle for enhancing the electrical activity of microorganisms(a)construction of a synthetic flavin biosynthesis pathway in S.oneidensis for enhancing extracellular electron transfer[89];(b)construction of flavins-selfassembled three-dimensional(3D)rGO biohybrid biofilm for enhancing power generation of MFC[90]

除了強化S.oneidensis 單菌黃素產量外，理性設計、構建高產黃素的人工混菌系統也能顯著強化MFC 的產電效率。Liu 等[91]設計了高產核黃素的B.subtilis 以及S. oneidensis MR-1 混合培養體系，將微生物燃料電池中的核黃素濃度從0.55 μmol/L 提高至5.32 μmol/L，顯著提升了電池體系內的電子傳遞速率。Yang 等[92]利用合成生物學策略改造E. coil，以木糖為底物將核黃素產量從3.3 μmol/L 提升至115.2 μmol/L，并與高度疏水的工程S. oneidensis MR-1 共同培養，成功將產電系統的功率密度提升了6.8倍；Liu等[93]構建了以葡萄糖為底物的“E.coil-B. subtilis-S. oneidensis”三菌互作產電系統。其中，E. coil 和B. subtilis 以葡萄糖為底物，分別為S.oneidensis MR-1提供電子供體乳酸和電子傳遞載體核黃素，而S.oneidensis MR-1 代謝生成的乙酸作為底物回補給E. coil 和B. subtilis，這使得放電過程的電子釋放率得到大幅提升，最終該系統的庫侖效率達到了55.7%。

吩嗪及其衍生物是一種以二氮雜蒽為碳骨架的化合物，當前已從自然界分離出包括吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid，PCA）、吩嗪-1-酰胺（phenazine-1-carboxamide，PCN）、綠 膿 菌 素（pyocyanin，PYO）在內的近百種吩嗪化合物。吩嗪類化合物作為電子載體參與細胞生理代謝已被廣泛研究[34,94-96]。Newman 等[97]研究發現，添加吩嗪類物質可以加快包括Geobacter 和Shewanella 在內的大多數電活性微生物的呼吸強度和胞外電子傳遞能力，Pham 等[34]通過添加實驗證實PCA、PCN 等吩嗪類物質可將微生物燃料電池的產電能力提升1.5倍。針對產電污泥的菌落分析證實，產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)可 以 利 用P. aeruginosa 產 出的吩嗪與電極形成新的呼吸鏈[98]。因此，提高MFC中吩嗪的濃度將顯著增強微生物的電化學活性從而提升MFC 的功率輸出能力。在模式產電菌P.aeruginosa PAO1中，磷酸烯醇丙酮酸經過phzA-G 等7 個基因合成PCA，之后經過phzS 和phzM 轉化為PYO，Schmitz 等[99]將來自P.aeruginosa PAO1 的吩嗪合成核心基因簇phzA-G 以及phzM 和phzS 在惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)中異源表達，使惡臭假單胞菌的PYO 產量達到45 mg/L，同時發現不具備產電能力的惡臭假單胞菌能夠檢測到電流輸出，實現了非電活性微生物向電活性微生物的轉化；Yong等[100]通過在P.aeruginosa 中過表達PYO 合成路徑中的phzM基因，將PYO的產量提高了1.6倍，顯著增強電池的產電能力。

除了針對吩嗪合成基因簇進行直接改造外，調節與吩嗪合成和分泌相關的調控因子也影響著吩嗪的產量。常見的吩嗪調控方式有群體感應系統、雙組分調節系統以及后轉錄調節，通過設計改造微生物吩嗪的調控方式對其產量進行人工干預是提升MFC 功率密度的重要手段。Venkataraman 等[101]對P. aeruginosa 中與GacS/GacA 雙組分調節系統相關的retS 突變型進行研究發現，突變菌株的吩嗪產量提升了39 倍，這使得電流水平提升了48 倍；Yong等[102]在P. aeruginosa 中過表達群體感應系統rhl 相關基因，使得MFC 的最大電流輸出提高了1.6 倍，分析發現相比野生型，工程菌合成了更多的吩嗪類化合物（0.4 g/ml PYO 和4 g/ml PCA），這說明QS 系統可以通過調節吩嗪的產量從而控制電流的輸出。

3 應用展望

電活性微生物驅動的微生物燃料電池在廢水處理、海洋能源開發、環境智能監測與修復、生物冶金以及生物計算等多方面展現出廣闊的應用前景。隨著電子傳遞機制研究的不斷深入，產電微生物的胞外電子傳遞速率和能量轉化效率有望逐漸實現量級突破，這將大大加快以產電微生物為核心的生物智能合成和生物電催化領域工業化進展，為綠色可持續性生產新能源或大宗精細化學品的生產提供新思路。

有機物被產電微生物攝取直至傳遞到電極，僅有約10%的電子能來到電極表面。在胞內反應過程中電子除了以電流的形式流出細胞，胞內反應還會消耗大量電子以參與還原態物質的合成、胞內能量代謝調控等過程；在周質電子傳遞過程中，復雜的周質氧化還原環境會分流胞內的部分電子，形成周質空間“電子逃逸”過程；隨著電子傳遞到細胞外周環境，電子在不穩態環境中極容易被環境中存在的氧氣等氧化態物質消耗造成電子流失。

為此，未來微生物產電系統設計還可以聚焦于以下方面：（1）依靠代謝工程分析產電細胞的胞內氧化還原反應，系統地測繪產電細胞胞內氧化還原過程，設計化學級聯效應更強的反應路徑以提高目標產物產量；（2）對周質空間氧化還原酶進行系統分析，按照對微生物生長的影響和化學反應親和勢判斷周質酶對電子的掠奪程度并通過合成生物學手段對周質空間進行清理，使得電子流更多流向與電極相關聯的色素蛋白；（3）尋找化工產品代替或修飾電極材料，通過改善產電微生物外周的電化學性能改變電子在外部環境的傳遞速率，同時擴充細胞與電極之間的電子通量，大大提升微生物燃料電池的功率輸出；（4）根據微生物電化學系統的動量、質量傳遞過程設計電化學反應器，通過反應器優化縮減反應過程中產生的熱力學、動力學損失，通過反應器結構優化加強微生物發酵過程與產電過程的耦合，保證能量的高密度輸出。