基于響應(yīng)面優(yōu)化法的新型生物納米材料的制備及應(yīng)用*

張濤

（1.福建師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350007；2.福建省污染控制與資源循環(huán)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350007）

隨著紡織工業(yè)的發(fā)展，印染廢水中殘余的有機(jī)染料所造成的環(huán)境污染已經(jīng)是一個全球關(guān)注的問題。殘余的有機(jī)染料大多含有芳香烴官能團(tuán)且能夠發(fā)生電離，其復(fù)雜的合成來源和分子結(jié)構(gòu)使其難以通過微生物降解等方法徹底去除[1,2]。孔雀石綠（MG,malachite green），是一種廣泛用于紡織品的染色和治療魚類微生物感染的人工合成的三苯基甲烷有機(jī)染料，其大量的使用會干擾自然光在水中的滲透度，導(dǎo)致自然水體和人工水體中水生植物的光合效率降低，從而影響水體中的含氧量，抑制水中生物的活性[3]；同時MG對人體有一定的毒性，孔雀石綠中的三苯甲烷分子與苯環(huán)相連的亞甲基和次甲基均易受到苯環(huán)的影響從而具有較高的反應(yīng)活性，可生成致癌官能團(tuán)之一的三苯甲基，能抑制人體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性，并與人體DNA嵌合生成有毒的加合物。這種情況會造成人體器官組織氧壓的改變和脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，誘發(fā)腫瘤產(chǎn)生[4]。因此，印染廢水中殘余的孔雀石綠的去除是目前紡織污水處理中亟需解決的問題之一。

氧化石墨烯（GO, graphene oxide）已在環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域中應(yīng)用并得到了廣泛的認(rèn)可，但是這種技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)和使用過程中還存在一些局限性，例如氧化石墨烯合成工藝中的還原過程需要運(yùn)用到大量的有毒有害化學(xué)試劑，這些化學(xué)試劑對人體健康和環(huán)境會造成一定的危害。氧化石墨烯在溶劑中的相容性較差，不易分散的性質(zhì)嚴(yán)重限制了其應(yīng)用效果等[5]。而傳統(tǒng)的微生物降解技術(shù)中的游離菌也容易受到微生物量不足，保留時間短以及降解效果波動性大等因素的影響，其對污染物的降解效果和穩(wěn)定性不夠理想[6]。綜上所述，為了克服以上這些技術(shù)發(fā)展的限制，需要研制一種新型復(fù)合生物材料去除印染廢水中的有機(jī)染料，而將綠色還原氧化石墨烯技術(shù)與微生物降解技術(shù)相結(jié)合則是目前環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域較為熱點(diǎn)的研究之一。

本研究中提出了一種簡單且環(huán)保的生物復(fù)合材料制備技術(shù)，以甘蔗渣為還原劑，采用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化合成還原氧化石墨烯（B-RGO,bagasse reduce graphene oxide）工藝參數(shù)，并負(fù)載具有可降解染料污染物MG能力的洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）制備生物納米材料（MNMs,Microbial nano-materials）[7]。同時采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析MNMs對孔雀石綠的降解產(chǎn)物。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

孔雀石綠（MG, malachite green）分子式：C23H25N2，為AR級，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

其他主要試劑：氯化鐵、硫酸鎂、氯化鈉、無水乙醇、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、葡萄糖、酵母胨均為AR級，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

主要大型儀器：原子吸收光譜240AA，購自安捷倫科技有限公司；紫外可見光譜UV1902，購自上海鳳凰城；氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀MSD5977，購自安捷倫科技有限公司；真空干燥箱DZF-6020，購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 洋蔥伯克霍爾德菌的培養(yǎng)和懸浮液制備

洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）購自上海北諾生物科技有限公司。

在培養(yǎng)環(huán)境條件為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，將洋蔥伯克霍爾德菌在液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)18 h以上，然后取適量樣品在轉(zhuǎn)速4000 r/min下離心10 min，離心去除上清液，收集下層的生物質(zhì)，用磷酸鹽緩沖液將其稀釋為OD600=0.7的細(xì)胞懸浮液。

1.2.2 氧化石墨烯的制備

采用改進(jìn)的Hummer方法制備氧化石墨烯懸浮液[5]。

1.2.3 甘蔗渣還原液的制備

用去離子水洗滌甘蔗渣3次，在烘箱中60 ℃下干燥24 h并研磨3次形成細(xì)膩均勻的粉末。再將4 g甘蔗渣粉末和300 μL硫酸加入去離子400 mL水中，在60 ℃下加熱5 h，然后冷卻至室溫后放置于冰箱中備用。

1.2.4 甘蔗渣還原氧化石墨烯的制備

取400 mL甘蔗渣還原液加入到400 mg/L的氧化石墨烯懸浮液中，然后在90 ℃， 150 r/min條件持續(xù)攪拌超過8 h，再將混合液以4000 r/min離心30 min收集沉淀并真空凍干48 h以制得固體材料還原氧化石墨烯（B-RGO）。

1.2.5 MNMs制備

將培養(yǎng)的1 5 mL 洋蔥伯克霍爾德菌懸浮液（OD600 =0.7，體積分?jǐn)?shù)=1.5%）與還原氧化石墨烯（B-RGO）顆粒混合置于含有礦物鹽培養(yǎng)基的錐形瓶中，并放置于振蕩培養(yǎng)箱中在150 r/min和30 ℃條件下持續(xù)培養(yǎng)24 h，直至所有細(xì)胞被固定在還原氧化石墨烯（B-RGO）的表面上。然后收集復(fù)合材料，獲得制備好的MNMs。

1.2.6 氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）

MG降解產(chǎn)物通過GC-MS進(jìn)行檢測。GC-MS柱為DB-5ms毛細(xì)管柱（30 m×0.25μm×0.25μm），進(jìn)樣溫度250 ℃，烘箱溫度50 ℃恒溫1 min，然后以15 ℃/min的速率升溫至290 ℃，在290 ℃下保持15 min。氣相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)在全掃描（m/z 100-700）下運(yùn)行。

1.2.7 去除效率的計(jì)算

去除效率W計(jì)算公式：

式中：

C0——孔雀石綠被吸附量的初始濃度，mg/L；

Ct——孔雀石綠被吸附量反應(yīng)后的濃度，mg/L；

W——去除率。

1.2.8 單影響因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

考察在不同的氧化石墨烯投加量（200、300、400、500 mg）及氧化石墨烯的還原反應(yīng)溫度（353、363、373 K）和還原時間（8、12、16 h）條件下，所制備的MNMs去除水溶液中孔雀石綠的效率。

1.2.9 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對比單因素試驗(yàn)結(jié)果的顯著性，以合適氧化石墨烯投加量及還原溫度和還原時間為因素，以孔雀石綠的去除率為響應(yīng)值，選擇3水平進(jìn)行試驗(yàn)，因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素及水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單影響因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1.1 氧化石墨烯投加量對孔雀石綠去除效果的影響

圖1 氧化石墨烯投加量對孔雀石綠去除效果的影響

由圖1可知，MNMs對孔雀石綠的去除效果隨著氧化石墨烯的投加量增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但總體影響不大，在投加量為400 mg是去除孔雀石綠的效率最高為95.1%，可能是MNMs有更多的吸附位點(diǎn)能夠吸附降解去除孔雀石綠[8]。

圖2 還原反應(yīng)溫度對孔雀石綠去除效果的影響

2.1.2 還原反應(yīng)溫度對孔雀石綠去除效果的影響 由圖2可知，在溫度范圍為353～373 K內(nèi)，較低的反應(yīng)溫度下合成的MNMs對孔雀石綠的去除效果低于較高反應(yīng)溫度下合成的MNMs，可能是較低的溫度不利于氧化石墨烯的還原，因此合成反應(yīng)溫度可選較高的范圍。

2.1.3 還原時間對孔雀石綠去除效果的影響

圖3 還原時間對孔雀石綠去除效果的影響

由圖3可知，還原氧化石墨烯（B-RGO）的合成時間對孔雀石綠的去除效率有一定的影響，反應(yīng)時間為8 h的材料對孔雀石綠的平衡去除率只能達(dá)到86.4%，而反應(yīng)時間在12～16 h的材料對孔雀石綠的平衡去除率均在90%左右，說明在一定時間范圍內(nèi)，較長的反應(yīng)時間對氧化石墨烯的還原更完全[9]，材料的去除效果更好。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對孔雀石綠去除率影響的3個單因素(氧化石墨烯投加量、氧化石墨烯還原溫度、時間)進(jìn)行組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)出17組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見表2。

2.2.2 方差結(jié)果與分析

運(yùn)用Design-Expert 12軟件，將得到的孔雀石綠去除率與氧化石墨烯投加量，材料合成溫度和時間進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到四元二次回歸方程：

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸模型方差分析與結(jié)果

Y=96.00+1.48A+0.775B+1.67C+0.575AB-1.03AC-0.525BC-3.71A2-5.56B2-4.26C2

其中Y為孔雀石綠的去除率。通過軟件分析得到回歸模型方差分析，結(jié)果如表3。

由表3可知，此失擬項(xiàng)P值=0.4899＞0.05，說明此實(shí)驗(yàn)的非試驗(yàn)因素影響小且誤差小，失擬項(xiàng)不顯著。R2=0.9874，RAdj2=0.9712說明該模型所得出的實(shí)際值和預(yù)測值有較好的擬合度，回歸模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)的擬合程度較好，可用來分析孔雀石綠的去除率與3個因素之間變化趨勢的預(yù)測[10]。由各影響因素的F值可知，對孔雀石綠去除率影響因素的主次順序?yàn)镃＞A＞B，即反應(yīng)時間＞氧化石墨烯投加量＞反應(yīng)溫度。

圖4 氧化石墨烯投加量與反應(yīng)溫度對孔雀石綠去除率的影響

圖5 氧化石墨烯投加量與反應(yīng)時間對孔雀石綠去除率的影響

圖6 反應(yīng)溫度與時間對孔雀石綠去除率的影響

通過Design-Expert 12軟件對響應(yīng)值Y（孔雀石綠去除率）與3個因素（A：氧化石墨烯投加量；B：反應(yīng)溫度；C：反應(yīng)時間）構(gòu)成的3D響應(yīng)面圖及等高線圖，以反映各因素（AB、AC、BC）其交互作用對孔雀石綠去除率的影響。3D響應(yīng)面圖的傾斜度表示了其中2個因素的交互作用對響應(yīng)值的影響程度，傾斜度越高則說明該因素對響應(yīng)值的影響越顯著；等高線圖的橢圓率代表了交互作用是否顯著，等高線越趨近于圓形代表交互作用不顯著，反之橢圓形趨勢的等高線則表示具有顯著的交互性[11]。由圖4、圖5、圖6可知，AB、BC的交互作用相比AC的交互作用較為顯著，此結(jié)果與表3中的分析結(jié)果一致。經(jīng)分析可得最優(yōu)參數(shù)為：氧化石墨烯投加量為399.1mg，反應(yīng)溫度為367 K，反應(yīng)時間為13.5 h。

2.3 GC-MS分析

圖7 MNMs去除孔雀石綠的產(chǎn)物分析

圖8 孔雀石綠可能的降解途徑

采用GC-MS對孔雀石綠及降解后的產(chǎn)物進(jìn)行分析，使用NIST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定。如圖3可知，當(dāng)保留時間為25.5 min經(jīng)鑒定為孔雀石綠的峰，經(jīng)過60 h的微生物降解后，在保留時間為6.5 min時出現(xiàn)一個新峰，在保留時間為21.5 min時也出現(xiàn)了一個新峰，對比NIST數(shù)據(jù)庫被證實(shí)降解產(chǎn)物是N,N-二甲基苯胺（m/z136；主要片段：136、121、94、65、39）和4-（二甲基氨基）二苯丙酮（m/z 225；主要片段：225，148，132，105，77）。其降解途徑可能是共軛顯色基團(tuán)結(jié)構(gòu)裂解產(chǎn)生了氨基苯衍生物，生成了N,N-二甲基苯胺（C8H11N）和4-（二甲基氨基）二苯甲酮（C15H15NO）[12]。

3 結(jié)論

⑴ 響應(yīng)面優(yōu)化法得到的最優(yōu)制備因素：氧化石墨烯投加量為399.1 mg，反應(yīng)溫度為367 K，反應(yīng)時間為13.5 h。在孔雀石綠初始濃度為50 mg/L的水溶液中有95.5%的孔雀石綠最后被MNMs去除。

⑵ GC-MS分析證實(shí)孔雀石綠最終被伯克霍爾德菌降解為N,N-二甲基苯胺（C8H11N）和4-（二甲基氨基）二苯甲酮（C15H15NO），這可能是因?yàn)榭兹甘G中的共軛顯色基團(tuán)結(jié)構(gòu)裂解而產(chǎn)生了氨基苯衍生物。

本研究證實(shí)綠色還原氧化石墨烯固定伯克霍爾德菌的微生物納米材料是一種具有去除染料廢水中有機(jī)污染物效果良好的功能性生物納米材料。該納米材料制備過程簡便，經(jīng)濟(jì)性好，去除效果顯著的特點(diǎn)而使其在印染廢水處理工程中具有廣闊的應(yīng)用前景。