丹荷顆粒治療高脂血癥質量標志物發現研究

馬兆臣，陳奎奎，潘琦雪，閆曉寧，劉 潔，蘇汝彬， 朱美霞，張銀環，陽 嬌，李 乾，肖紅斌,4*

(1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100029；2.北京中醫藥大學 中藥分析與轉化研究中心，北京 100029； 3.北京中醫藥大學 中醫藥研究院，北京 100029；4.石河子大學 藥學院，新疆 石河子 832002)

丹荷方來源于名老中醫郭維琴臨床經驗方，由荷葉、丹參、山楂、虎杖、陳皮、薏苡仁6味藥組成，功效為活血消食、祛濕健脾，臨床用于治療痰瘀互阻型高脂血癥，能夠顯著降低高脂血癥金黃地鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三油酸酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，并顯著升高血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平[1]。該方目前處于中藥新藥臨床前藥學研究階段，且已成功制成丹荷顆粒(Danhe granules,DHG)劑，但缺乏相應的質量控制標準。質量控制的根本目的是對中藥有效性的控制，而劉昌孝院士所提出的中藥質量標志物概念[2]，將藥效相關性作為質量標志物確定的重要原則并嚴格控制，已成為規范中藥質量、提高中藥及其制劑質量一致性的可行方法。

DHG作為尚在研發的中藥新藥，有效成分特征及含量穩定對其至關重要，由此確定DHG質量標志物篩選的四要素為降脂藥效、成分特征、含量可測及穩定存在。目前，中藥藥效相關質量標志物研究方法的核心在于建立活性成分與藥效、作用機制的關聯[3-6]。其中網絡藥理學方法通過對復雜多層次相互作用的各種網絡的分析[7]，可直觀地表明成分與作用機制間的關系，有助于快速發現中藥潛在有效性質量標志物[8-9]。本研究基于網絡藥理學方法，通過對成分靶點及疾病基因共有靶點的生物過程、通路富集及網絡拓撲分析，確定DHG降脂關鍵靶點及相應作用成分；而后建立了油酸(OA)誘導的HepG2脂質堆積細胞模型對成分活性進行驗證；最后綜合活性成分在制劑中的含量、穩定性、特征性，確定DHG治療高脂血癥的質量標志物，以期為后續DHG質量標準的建立提供合理的候選質控指標。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

人肝癌細胞系(HepG2)購自中國科學院(上海)；DMEM高糖培養基、0.25%胰蛋白酶(含乙二胺四乙酸，EDTA)、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖鹽(PBS)、胎牛血清(FBS)均來源于Hylcone(Thermo scientific，美國)；青霉素-鏈霉素(Amresco，美國)；6孔細胞培養板(Costar，美國)；Eppendorf管(Axygen，美國)；油酸、二甲基亞砜(DMSO)、油紅O染液、4%多聚甲醛固定液(Sigma，美國)；異丙醇(LC-MS級，Fisher，美國)；甘油三酯(TG)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Bradford試劑盒、細胞裂解液(碧云天生物技術有限公司)；白藜蘆醇(批號B-002-170426)、柚皮素(批號Y-034-181217)(純度≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)。

生物安全柜(HFease1800，上海力康醫療設備有限公司)；3111 CO2培養箱(Thermo，美國)；超凈臺(哈爾濱東聯電子技術開發有限公司)；細胞培養板(Corning，美國)；IX71倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本)；3-18KS高速冷凍離心機(Sigma，德國)；Infinite 200 Pro Nanoquant連續波長多功能酶標儀(Tecan,瑞士)。

1.2 溶液配制

柚皮素、白藜蘆醇用DMSO超聲溶解，配成10 mmol/L的母液，轉移至生物安全柜中加基礎培養基稀釋為10 μmol/L的給藥溶液(含0.1% DMSO)，過0.22 μm微孔濾膜，待用。取0.056 g氫氧化鉀、10 mL PBS、0.1 g BSA，渦旋混勻后加入31.6 μL油酸，得10 mmol/L油酸溶液，過0.22 μm濾膜后于-20 ℃保存，使用時用基礎培養基稀釋成200 μmol/L的油酸造模液，按照油紅O∶PBS=3∶2混合，過0.22 μm微孔濾膜后即制成油紅O染色液，在2 h內使用。

1.3 實驗方法及數據處理

1.3.1 DHG體內成分收集課題組前期對給藥后SD大鼠血漿、尿液及糞便中成分進行分析，共鑒定出36個原型成分，可能是DHG治療高脂血癥潛在活性成分，并將其用于后續網絡藥理學的研究。

1.3.2 成分靶點及疾病基因預測采用STITCH數據庫(http://stitch.embl.de/)和Swiss target prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)對DHG中成分的作用靶點進行預測，從STITCH “chemical aliases”文件和“protein chemical links detailed”文件中收集化合物同名成分及相關靶點，保留與成分結合得分≥700的靶點；從Swiss target prediction收集概率值≥0.5的靶點；而后將得到的所有靶點導入UniProt數據庫，提取其Gene Name和Gene ID。本研究以“Hyperlipidaemia”即高脂血癥為主題詞，基于TTD (http://bidd.nus.edu.sg/bi-dd.databases/ttd/ttd.asp)及Gen-eCards (https://www.genecards.org)數據庫收集高脂血癥疾病相關人源基因。為避免假陽性靶點，剔除TTD中基因類型為“Discontinued”以及GeneCards中相關得分<10的基因。

1.3.3 共有靶點生物功能與通路富集分析將丹荷顆粒成分作用靶點與高脂血癥疾病基因比對，獲得成分靶點與疾病基因共有靶點，再將共有靶點導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/,Version 6.8)，Select identifier設置為uniprot_accession，限定物種為Homo Sapiens，閾值為P<0.05，對靶點進行GO生物過程分析和KEGG通路分析。

1.3.4 共有靶點交互作用分析“度”(Degree)是衡量網絡節點重要性的最直接方法，度值越大的節點在網絡中越重要。將共有靶點導入STRING數據庫(https://string-db.org/)，物種選擇Homo Sapiens，構建共有靶點交互作用網絡，將網絡中各節點的交互作用參數導入Cytoscape 3.7.0軟件以繪制交互網絡，并將節點(node)大小和顏色深淺與度值大小對應，邊(Edge)的粗細與結合分數大小對應。通過關鍵節點分析插件Network Analyzer計算共有靶點在交互作用網絡中的度值。

1.3.5 成分-共有靶點-疾病網絡構建收集丹荷顆粒成分作用靶點與高脂血癥疾病基因,導入Cytoscape 3.7.0構建成分-共有靶點-疾病網絡。

1.3.6 HepG2細胞培養、造模及給藥HepG2細胞培養于含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM高糖培基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞生長至約80%時用0.25%胰蛋白酶將其消化并傳代，取對數生長期細胞進行實驗。將對數生長期細胞制成細胞懸液，以5×105個/mL接種于6孔板，每孔2 mL細胞懸液。將細胞分為空白對照組(Con)、模型組(OA)、白藜蘆醇給藥組(OA+Res)和柚皮素給藥組(OA+Nar)，每組設置3個復孔，培養24 h后，空白對照組給予基礎培養基，其余各組用含200 μmol/L油酸的基礎培養基刺激細胞24 h，制成脂質堆積模型。而后空白對照組給予含0.1% DMSO的基礎培養基，給藥組棄去造模液，分別加入終濃度為10 μmol/L的含白藜蘆醇、柚皮素基礎培養基，繼續培養24 h。

1.3.7 油紅O染色及測定經含白藜蘆醇、柚皮素基礎培養基培養24 h后，所有組吸棄培養基，PBS洗3次，棄去；用0.4%的多聚甲醛室溫固定20 min，棄去；每孔加入500 μL油紅O染色液避光染色30 min，棄去；每孔加入1 mL 60%異丙醇溶液分化5 s，PBS洗2次，棄去；200×放大倍數鏡檢拍照；每孔加入500 μL異丙醇室溫孵育10 min，用酶標儀測定其510 nm處吸光值。

1.3.8 TG含量測定細胞分組、給藥及處理同“1.3.6”方法。給藥24 h后用預冷PBS洗滌2次。每孔加入100 μL 2%Tritonx-100裂解液，冰上裂解30 min，裂解好的液體不離心直接測定。參照甘油三酯(TG)測定試劑盒說明書檢測細胞內TG含量，計算公式為TG含量(mmol/gprot)=(樣本OD值-空白OD值)/(校準OD值-空白OD值)×校準品濃度(2.26 mmol/L) ÷待測樣本蛋白濃度(gprot/L)。

2 結果與討論

2.1 DHG體內成分收集

本研究最初通過TCMSP等中藥成分數據庫獲取DHG成分，并通過藥代動力學參數中的口服生物利用度(OB)確定DHG口服生物利用度較好的成分(OB≥30%)，但發現DHG部分重要降脂活性成分如丹酚酸B[10]、橙皮苷[11]、虎杖苷[12]等的OB分別為3.01%、13.33%、21.44%，生物利用度較差，與本課題組對DHG體內成分鑒定結果不一致。藥物代謝研究認為中藥活性成分可能為原型成分或其代謝產物[13]，故基于丹荷顆粒真實存在于體內的成分進行網絡藥理學分析，以縮小潛在活性成分的范圍。為避免遺漏重要活性成分，采用DHG給藥后血漿、尿液及糞便中原型成分作為網絡藥理學研究的成分來源，結果見表1。

表1 DHG成分庫Table 1 Component library of DHG

表2 DHG降脂作用靶點Table 2 Lipid-lowering targets of DHG

2.2 共有靶點

基于Swiss target prediction和STITCH數據庫，分別得到264和179個成分作用靶點，刪除重復項，得到DHG成分作用靶點268個。基于TTD及GeneCards數據庫，分別得到高脂血癥疾病基因23及57個。通過比對分析丹荷顆粒成分靶點以及高脂血癥疾病基因，得到10個共有靶點，這些共有靶點可能是DHG降脂的作用靶點(見表2)。

2.3 共有靶點生物過程與通路富集分析

共有靶點生物過程分析結果(P<0.01)見圖1，較為顯著的生物過程包括脂質代謝過程、類固醇激素介導的信號通路過程以及脂蛋白分解代謝過程，其中LDLR、PPARA、PPARG靶點參與的脂質代謝過程可能是DHG治療高脂血癥最重要的生物過程，其他生物過程包括受體生物合成過程的負調控、甘油三酯隔離的負調節、膽固醇儲存負調節、脂肪酸氧化的正調控、低密度脂蛋白顆粒清除率等。共有靶點通路富集結果(P<0.05)見圖2，PPARA、PPARG參與的PPAR信號通路以及LDLR、ADORA1、ADORA2A參與的cAMP信號通路是最顯著的代謝通路，可能是DHG降脂作用最重要的代謝通路，其他通路包括脂肪細胞脂解的調控、卵巢類固醇生成、催乳素信號通路等。

圖1 DHG成分生物過程分析Fig.1 Biological process analysis of components in DHG

2.4 共有靶點交互作用分析

共有靶點交互作用網絡見圖3，該網絡由10個節點和31條邊組成。在共有靶點交互作用網絡中，ESR1、PPARG、PPARA、LDLR、APOB是度值(分別為9、8、7、7、7)最大的5個節點，是網絡中的重要靶點。

圖2 DHG成分通路富集分析Fig.2 Pathway enrichment analysis of components in DHG

圖3 共有靶點蛋白互作網絡Fig.3 Protein interaction network with common targets

圖4 DHG成分-共有靶點-疾病網絡Fig.4 DHG components-common targets-disease network

2.5 關鍵靶點分析

基于中藥多靶點、多途徑的作用特點，關鍵靶點的確定需根據靶點交互作用及共有靶點生物過程、通路富集結果綜合確定。故本研究進一步結合重要通路即PPAR、cAMP通路參與靶點(PPARA、PPARG、LDLR、ADORA1、ADORA2A)以及重要代謝過程即脂質代謝過程的參與靶點(LDLR、PPARA、PPARG)，發現PPARG、PPARA、LDLR可能是DHG降脂作用的關鍵靶點，在DHG降脂過程中發揮著重要作用。此外，本課題組體內實驗研究也發現DHG治療高脂血癥金黃地鼠模型作用機制與上調LDLR、PPARA的mRNA和蛋白表達水平有關，這在一定程度上證明了本研究的可靠性[1]。

2.6 關鍵活性成分分析

為了明確作用于關鍵靶點PPARG、PPARA、LDLR的活性成分，使用Cytoscape軟件構建成分-共有靶點-疾病網絡(圖4)，該網絡包括21個節點及30條邊，10個節點是共有靶點，另外10個節點則是與共有靶點有直接作用關系的成分。同時發現白藜蘆醇與柚皮素是作用于關鍵靶點的成分，可能是DHG降脂作用的關鍵活性成分。

2.7 體外活性驗證

圖5 白藜蘆醇、柚皮素對HepG2細胞內脂質堆積影響

HepG2細胞經油酸處理后，其形態與脂質堆積肝細胞相似[14-15]，是體外研究脂代謝的理想載體，故本研究采用油酸誘導的HepG2細胞脂質堆積模型驗證白藜蘆醇(Res)及柚皮素(Nar)的藥效。油紅O染色結果(圖5)表明，經油酸處理后，模型組細胞外圍輪廓變圓，細胞間距離增大，胞漿內顆粒狀脂質被染成鮮紅色，并呈戒指環狀緊密地分布在細胞膜外，說明脂質堆積細胞模型建立成功。與模型組相比，10 μmol/L白藜蘆醇及柚皮素均能夠減少HepG2細胞內紅色脂質含量。油紅O染色定量測定結果表明，與對照組比較，模型組在510 nm處吸光值升高189.05%；與模型組比較，白藜蘆醇組降低20.01%，柚皮素組降低31.61%，差異具有統計學意義，說明白藜蘆醇、柚皮素能夠顯著降低HepG2細胞內脂質含量(圖6A)。為進一步確定白藜蘆醇、柚皮素的降脂效果，對細胞內TG含量進行測定(圖6B)。結果表明，與對照組相比，模型組TG含量升高152.00%；與模型組比較，白藜蘆醇組降低了53.06%，柚皮素組降低了27.89%，差異具有統計學意義，且白藜蘆醇甚至可以將細胞內TG含量恢復至對照組同等水平，進一步說明白藜蘆醇、柚皮素可顯著降低HepG2細胞內脂質含量，可能為DHG降脂的關鍵活性成分。

2.8 質量標志物的確定

柚皮素和白藜蘆醇在DHG中含量較低；而兩者分別是DHG主要成分柚皮苷和虎杖苷的體內代謝產物，柚皮苷、虎杖苷進入體內后會在肝藥酶、腸道菌群的作用下被迅速代謝為苷元-柚皮素、白藜蘆醇[16-17]。文獻報道對高脂血癥倉鼠和家兔的研究發現虎杖苷可顯著降低血清TC、TG和LDL-C水平[18-19]，而柚皮苷也可通過增強膽固醇的反向運輸發揮較好的調節血脂的作用[20-21]，提示虎杖苷和柚皮苷可能通過原型及其苷元的形式同時發揮降脂藥效。此外，白藜蘆醇及柚皮素分別為蓼科植物二苯乙烯苷類以及柑橘屬中藥黃酮類生物合成途徑的中心中間體[22-23]。虎杖苷和柚皮苷可分別由白藜蘆醇和柚皮素通過其結構特定羥基位置的糖基化反應獲得，而白藜蘆醇在植物中含量極少，主要以虎杖苷的形式存在于虎杖植物中[24]；相似的，柚皮苷也是陳皮中主要的柑橘類黃酮[25]，因此白藜蘆醇、柚皮素、虎杖苷、柚皮苷可作為DHG特征性成分；與此同時，課題組前期研究發現柚皮苷及虎杖苷在DHG中的含量分別為(3 085.40±74.30) μg/g及(2 592.40±102.00) μg/g，為DHG的主要成分；同時柚皮苷及虎杖苷在10批DHG制劑中的含量變化較小(90% ≤P≤110%，RSD≤15%)，能夠穩定存在[26]。因此認為活性成分柚皮素、白藜蘆醇的前體成分柚皮苷、虎杖苷可作為DHG治療高脂血癥的質量標志物。

3 結 論

科學合理的質控指標對在研新藥DHG至關重要。本研究在中藥質量標志物概念的指導下，從成分的有效性、特征性、可測性及穩定性綜合研究DHG質量標志物，最后確定其中與降脂功效相關、特征明顯、含量豐富、穩定存在的成分虎杖苷及柚皮苷為DHG質量標志物，從而為后續DHG質量標準的建立奠定基礎。