LncRNA MEG3表達量與脂多糖誘導支氣管上皮細胞增殖及凋亡和炎癥因子分泌的關系*

何秀 張碧清 劉春花

(1.郴州市第一人民醫院兒科，湖南 郴州 423000;2.郴州市第一人民醫院兒童醫院兒童呼吸科，湖南 郴州 423000)

支氣管哮喘屬于慢性氣道炎癥類疾病之一，支氣管上皮細胞損傷在支氣管哮喘發生過程中發揮重要作用[1-2]。既往研究顯示支氣管上皮細胞釋放出炎性因子可引發機體炎癥反應從而造成損傷[3]。目前支氣管哮喘發病機制尚未闡明，因而從支氣管上皮細胞角度出發探究支氣管哮喘發病機制具有重要意義。長鏈非編碼RNA母系表達基因3(Long non-coding RNA MEG3，LncRNA MEG3)表達水平降低可增強脂多糖(lipopolysacharide，LPS)誘導的肺細胞損傷[4]。但MEG3在支氣管哮喘發生過程中的調控機制尚未闡明。研究表明LPS作為一種促炎因子可用于炎癥性疾病的體外研究[5-7]。本研究分析LPS對支氣管上皮細胞增殖、凋亡及炎癥因子分泌的影響，探討干擾MEG3表達或MEG3過表達對LPS誘導的支氣管上皮細胞增殖、凋亡及炎癥因子分泌的影響，為支氣管哮喘發病機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人支氣管上皮細胞16HBE購自美國ATCC細胞庫；杜氏改良培養基(DMEM)、胎牛血清均購自美國HyClone公司；膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)細胞凋亡試劑盒購自美國BD公司；白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)與白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；脂多糖(LPS)與甲基噻唑基四唑(MTT)購自美國Sigma公司；Lipofectamine2000、Triol試劑盒、反轉錄試劑盒與實時熒光定量檢測試劑盒均購自美國Invitrogen公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒購自湖南艾佳生物科技股份有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液購自福因德科技(武漢)有限公司；MEG3小干擾RNA(si-MEG3)、亂序無意義陰性序列(si-con)購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1購自上海柯雷生物科技有限公司；兔抗人活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Cleaved caspase-9)、細胞周期蛋白1(CyclinD1)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 LPS處理與實驗分組 預先配置含有10%胎牛血清與100 U/mL青霉素與100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，將支氣管上皮細胞16HBE置于培養基中進行培養，培養條件：37 ℃、體積分數5%CO2培養箱，待單層細胞覆蓋率達到90%時進行傳代培養。取對數生長期支氣管上皮細胞，用50 μg/mL的LPS處理細胞24 h[8]作為LPS組，正常培養的細胞作為NC組。分別將si-MEG3、si-con、pcDNA-MEG3、pcDNA轉染至支氣管上皮細胞48 h，隨后使用50 μg/mL的LPS處理細胞24 h，分別命名為LPS+si-MEG3組、LPS+si-con組、LPS+pcDNA-MEG3組、LPS+pcDNA組，轉染過程參照Lipofectamine2000試劑說明書進行操作，收集細胞進行后續研究。

1.2.2 ELISA檢測IL-8、IL-1β濃度 收集各組細胞培養上清液，依據ELISA檢測試劑盒檢測IL-8、IL-1β水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖率 取NC組、LPS組、LPS+si-con組、LPS+si-MEG3組、LPS+pcDNA組、LPS+pcDNA-MEG3組支氣管上皮細胞，0.25%胰蛋白酶消化，制備單細胞懸液，調整細胞密度至3×104個/mL，取100 μL細胞懸液接種于96孔板，各組設置3個復孔，培養48 h后每孔加入20 μL質量濃度為5 mg/mL的MTT溶液，室溫孵育4 h，12000 r/min轉速離心5 min，棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，放入振蕩儀勻速振蕩10 min，應用酶標儀檢測波長為490 nm處各孔吸光度值(OD)，計算各組細胞增殖率[(實驗組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100%]，實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集NC組、LPS組、LPS+si-con組、LPS+si-MEG3組、LPS+pcDNA組、LPS+pcDNA-MEG3組支氣管上皮細胞，0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min轉速離心6 min，棄上清，PBS清洗，加入500 μL結合緩沖液，加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，室溫避光孵育10 min，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測細胞中MEG3的表達水平 收集各組支氣管上皮細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計測定RNA濃度，根據反轉錄試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA。MEG3正向引物5′-GGGCTTCTGGAATGAGCA TG-3′，反向引物：5′-TCTATGCCAGATCCTGCCT G3′；β-actin正向引物5′-TGCTGTCCCTGTATGCC TCT-3′，反向引物：5′-TGATGTCACGCACGATT T-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。qRT-PCR反應體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，RNase-Free ddH2O補足體系至20 μL；反應條件：95℃ 2 min(循環1次)，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s(循環40次)，MEG3以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算MEG3的相對表達量。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、CyclinD1蛋白表達 收集各組支氣管上皮細胞，加入RIPA裂解液，冰浴30 min，離心(4 ℃，1000 r/min，10 min)，提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，取30 μg蛋白上樣量加入SDS上樣緩沖液，沸水中煮10 min。取蛋白樣品進行SDS-PAGE反應，將電泳產物轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃條件下孵育一抗稀釋液(24 h)，TBST洗滌，孵育二抗稀釋液，室溫孵育1 h，TBST洗滌，曝光，顯影，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結果

2.1 LPS誘導支氣管上皮細胞炎癥反應和抑制增殖的作用 與NC組相比，LPS組支氣管上皮細胞中炎癥因子IL-8、IL-1β水平均明顯升高(P<0.05)，細胞增殖率顯著降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 Western blot檢測支氣管上皮細胞CyclinD1蛋白表達Figure 1 Western blot detection of CyclinD1 protein expression in bronchial epithelial cells

表1 LPS誘導支氣管上皮細胞炎癥因子IL-8和IL-1β分泌及抑制增殖的作用Table 1 Effects of LPS on the secretion of inflammatory factors IL-8 and IL-1β in bronchial epithelial cells and inhibition of proliferation

2.2 LPS誘導支氣管上皮細胞凋亡 相較于NC組，LPS組支氣管上皮細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，見圖2、表2。

圖2 Western blot檢測支氣管上皮細胞Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表達及流式細胞術檢測細胞凋亡率Figure 2 Western blot detection of Cleaved caspase-3 and Cleaved caspase-9 protein expression in bronchial epithelial cells and flow cytometry to detect the apoptosis rate

表2 LPS誘導支氣管上皮細胞凋亡及上調Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白Table 2 LPS-induced bronchial epithelial cell apoptosis and up-regulated Cleaved caspase-3 and Cleaved caspase-9 proteins

2.3 LPS抑制支氣管上皮細胞MEG3表達 LPS組MEG3的表達水平(0.42±0.06)較NC組(0.97±0.05)顯著降低(P<0.05)。

2.4 干擾MEG3加重LPS誘導支氣管上皮細胞凋亡和抑制增殖的作用 與LPS+si-con組相比，LPS+si-MEG3組支氣管上皮細胞中MEG3的表達水平顯著降低(P<0.05)，提示成功降低支氣管上皮細胞中MEG3的表達；相比于LPS+si-con組，LPS+si-MEG3組支氣管上皮細胞中IL-8、IL-1β水平、細胞凋亡率、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白相對表達量均顯著升高(P<0.05)，細胞增殖率、CyclinD1蛋白相對表達量均顯著降低(P<0.05)，見圖3、表3。

圖3 Western blot檢測支氣管上皮細胞CyclinD1、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表達及流式細胞術檢測細胞凋亡率Figure 3 Western blot detection of cyclinD1,cleaved caspase-3,and cleaved caspase-9 protein expression in bronchial epithelial cells and detection of apoptosis rate by flow cytometry

表3 沉默MEG3和LPS誘導對支氣管上皮細胞炎癥因子IL-8和IL-1β分泌、細胞增殖及細胞凋亡的作用Table 3 Effects of silent MEG3 and LPS induction on the secretion of inflammatory factors IL-8 and IL-1β,cell proliferation and apoptosis in bronchial epithelial cells

2.5 過表達MEG3部分逆轉LPS誘導支氣管上皮細胞凋亡和抑制增殖的作用 與LPS+pcDNA組相比，LPS+pcDNA-MEG3組支氣管上皮細胞中MEG3的表達水平、細胞增殖率、CyclinD1蛋白相對表達量均顯著升高(P<0.05)，IL-8、IL-1β水平、細胞凋亡率、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白相對表達量均顯著降低(P<0.05)，見圖4、表4。

表4 過表達MEG3和LPS誘導對支氣管上皮細胞炎癥因子IL-8和IL-1β分泌、細胞增殖及細胞凋亡的作用Table 4 Effects of overexpression of MEG3 and LPS on the secretion of inflammatory factors IL-8 and IL-1β,cell proliferation and apoptosis in bronchial epithelial cells

圖4 Western blot檢測支氣管上皮細胞CyclinD1、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表達及流式細胞術檢測細胞凋亡率Figure 4 Western blot detection of cyclinD1,cleaved caspase-3,and cleaved caspase-9 protein expression in bronchial epithelial cells and flow cytometry to detect the apoptosis rate

3 討論

LncRNA在支氣管上皮細胞惡性轉化過程中發揮重要作用，但關于其具體作用機制尚未完全闡明[9-11]。研究表明LPS可誘導支氣管上皮細胞構建炎癥模型[12-13]。因而本研究主要探尋新型LncRNA并分析其對LPS誘導的支氣管上皮細胞炎癥損傷的影響。

本研究結果顯示LPS處理后支氣管上皮細胞炎癥因子 IL-8、IL-1β生成量均顯著升高，與鄭輝等[14]報道相似，提示LPS誘導的支氣管上皮細胞炎癥損傷模型構建成功，LPS誘導后支氣管上皮細胞增殖率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，提示LPS可通過抑制支氣管上皮細胞增殖及促進細胞凋亡從而造成細胞損傷。研究表明CyclinD1表達量升高可促進細胞周期由G1期進入S期，促進細胞增殖[15]。Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9表達量升高可誘導細胞凋亡[16]。本研究結果顯示LPS誘導的支氣管上皮細胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表達水平顯著升高，CyclinD1蛋白表達水平顯著降低，提示LPS對支氣管上皮細胞增殖及凋亡的作用機制可能與上調Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9表達及下調CyclinD1表達有關。

MEG3在骨性關節炎患者軟骨組織中呈低表達并可能通過調控血管生成從而參與骨性關節炎發生及發展過程[17]。研究表明MEG3在冠狀動脈粥樣硬化中呈低表達并可能參與心血管疾病發生及發展過程[18]。相關報道指出MEG3在急性髓系白血病骨髓中表達下調并可能作為急性髓系白血病患者預后不良的重要標志物[19]。但MEG3對LPS誘導的支氣管上皮細胞炎癥損傷的影響尚未可知。本研究結果顯示LPS誘導的支氣管上皮細胞中MEG3表達下調，干擾MEG3表達后可明顯促進LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡，抑制細胞增殖，增加IL-8、IL-1β生成量，促進Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表達，抑制CyclinD1蛋白表達，提示干擾MEG3表達可加重LPS誘導的支氣管上皮細胞損傷；MEG3過表達后可抑制LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡，促進細胞增殖，降低IL-8、IL-1β生成量，Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表達下調，CyclinD1蛋白表達上調，說明MEG3過表達可逆轉LPS誘導支氣管上皮細胞凋亡及抑制增殖的作用。提示MEG3過表達可減輕LPS誘導的支氣管上皮細胞損傷。

4 結論

MEG3過表達可促進LPS誘導支氣管上皮細胞增殖，抑制細胞凋亡，減輕炎癥反應。