microRNA-22-3p低表達上調幼年哮喘氣道重塑大鼠的NK1R表達*

宋建剛 高永偉 劉慶 賈鯤鵬 龐隨軍 李元霞

(延安大學附屬醫院兒科,陜西 延安 716000)

哮喘是一種慢性炎癥性氣道疾病，其特征在于可逆性氣流阻塞和氣道高反應性[1]。炎癥細胞釋放的炎癥介質引起持續的氣道慢性炎癥，從而在哮喘過程中觸發支氣管收縮和氣道結構變化[2]，后者最初是作為響應炎癥引起的氣道壁損傷而啟動的修復過程，然而，這種修復過程的失調導致氣道重塑[3]。近年來我國小兒哮喘的患病率顯著增加，為個人、家庭、社會均帶來了巨大的負擔[4-5]。因此，研究新的哮喘診斷和預后靶點以及開發新的治療策略以逆轉氣道重塑至關重要。

MicroRNA(微小RNA，miRNA)是轉錄后基因表達調節劑的一大家族，其長度約為21個核苷酸，可控制真核生物中的許多細胞和發育過程[6]。新的研究表明，多種miRNA的表達水平與哮喘和氣道炎癥有關，包括miR-21、miR-223和miR-142-3p[7]。miR-22是多種細胞增殖和炎癥反應的抑制因子。研究[8]表明，miR-22可以抑制RASF滑膜成纖維細胞增殖和促炎細胞因子的產生。大量研究發現，miR-22前提的3p臂成熟體miR-22-3p可抑制肝癌[9]、結腸癌[10]、胃癌細胞的增殖[11]。研究表明miR-22-3p能夠調節乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移，該過程是通過負調節神經激肽受體1(neurokinin receptor 1,NK1R)發揮作用[12]。研究表明，感覺神經肽NK1R與小兒哮喘的發作及緩解關系極為密切[13]，例如豚鼠哮喘模型急性期的支氣管中NK1R的表達增多，而且在藥物作用下可以抑制哮喘大鼠模型中的NK1R表達[14-15]。但其在哮喘氣道重塑中是否受到miRNA調節仍不明確。因此，本研究探討miR-22-3p在幼年哮喘大鼠氣道重塑過程中是否靶向調節NK1R，為確定新的幼小兒哮喘預后和治療靶標提供前期基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑 OVA購買于上海生工生物技術有限公司(貨號：A003056-0100)；氫氧化鋁購買于北京Solarbio科學技術公司(貨號：A7130)；TRIzol試劑盒購買于美國的英杰公司(貨號：15596018)；大鼠氣道平滑肌細胞(Rat airway smooth muscle cells,RASMCs)購買于美國培養物保藏中心(貨號：#AC340472)；TIANamp基因組DNA試劑盒購于北京天根生物技術公司(貨號：DP348)；熒光素酶報告基因測定試劑盒購買于美國普洛麥格公司(貨號：E1310)；NK1R，β-actin的抗體和第二抗體均購于美國Abcam公司(貨號：ab183713，ab115777)。

1.2 動物分組 48只體重62 ～79 g的5周齡的無特定病原體(SPF)等級幼年雌性Wistar大鼠(延安大學醫學院動物研究中心提供)，飼養、飲水、光照和溫度均保持在恒定水平，所有動物均在SPF條件下飼養。設施中的環境條件符合“實驗動物對環境和住房設施的要求(GB14925-2001)”中有關實驗動物隔離設施的相關準則。隨機分為對照組、模型組、模型+mimic組、模型+mimic-NC組、模型+inhibitor組、模型+inhibitor-NC組，每組各8只。

1.3 動物模型構建和治療 大鼠接受適應性喂養1周。適應后第1 d開始，給大鼠1 mL誘導劑(包含100 mg卵白蛋白和200 mg 氫氧化鋁，腹腔注射)。15 d開始暴露。將大鼠置于一個特殊的密閉玻璃容器中(20 cm×20 cm×20 cm)，將含有1%中的OVA的50 mL 生理鹽水注入進行霧化激發，將大鼠每周3次暴露于這種治療30 min，連續8周。對照組僅接受生理鹽水注射。在暴露期后24 h內處死大鼠[16]。另外，模型+mimic組、模型+mimic-NC組、模型+inhibitor組、模型+inhibitor-NC組對大鼠的處理為大鼠每次激發前1 h內分別尾靜脈注射1 mL的mimic、mimic-NC、inhibitor、inhibitor-NC，濃度均為(10 μg/mL)[17-18]。分離氣管、支氣管和肺組織，結扎后取出右中肺。將肺標本保存在4%多聚甲醛中，隨后進行常規石蠟包埋，切片和蘇木精-伊紅(H&E)染色。在顯微鏡下評估氣道病理。

1.4 病理圖像分析 用顯微鏡對完整的肺橫截面成像，并使用Leica Application Suite V4.3圖像分析軟件測量肺壁的內周(Pi)、面積(WA)和外周(Pe)，支氣管平滑肌面積(S)和支氣管平滑肌細胞核數(N)。使用Pi和S對這三個測量值進行歸一化，并表示為WA/Pi2、S/Pi2和N/S。

1.5 定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR) 使用TRIzol一步法從RASMCs細胞和氣道組織中提取總RNA。用少量液氮將組織研磨成均勻的粉末，隨后加入Trizol試劑提取RNA。將焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的超純水加到混合物中以溶解RNA。使用ND-1000紫外可見分光光度計測量260 nm和280 nm的光密度(OD)。測定總RNA的質量，并相調節RNA濃度。采用兩步法對提取的RNA進行反轉錄。使用以下反應條件：70 ℃ 10 min，冰浴2 min，42 ℃ 60 min和70 ℃10 min。將反轉錄的cDNA暫時置于-80 ℃。RT-qPCR使用TaqMan探針法進行。反應條件如下：在95 ℃下預變性30 s的一個循環，隨后在95 ℃下進行40個循環的10 s變性，在60 ℃下退火10 s。并在70 ℃下延伸10 s。U6用于miR-22-3p的內參基因，β-actin用于NK1R基因的內參基因。使用相對定量方法，將每個靶基因的相對表達倍數表示為2-ΔΔCt。每個實驗重復3次。

1.6 Western blot 從RASMCs細胞和氣道組織中獲得總蛋白樣品，使用12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將不同大小的蛋白分離開。將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，在室溫下使用含有5%牛血清白蛋白(BSA)的Tris緩沖鹽水-Tween(TBS-T)封閉1 h。將膜與抗NK1R和β-actin的一抗進行孵育，過夜。然后將膜在TBS-T中沖洗(每次3次×10 min)。然后，膜與二抗進行孵育。6 h后，將膜用TBS-T洗滌(每次3次×15 min)。化學發光試劑A溶液和B溶液以1∶1的比例混合，最后將混合物均勻滴在膜上，使膜顯影，并對所有免疫印跡帶進行相對密度分析。

1.7 RASMCs培養 RASMCs在DMEM培養基中培養(37 ℃，5%CO2)。每2 d換液一次，細胞鋪滿培養皿時，用0.25%的胰蛋白酶消化并傳代細胞。用含有10%FBS的DMEM代替培養基。

1.8 雙熒光素酶基因報告實驗 利用生物信息學預測網站microRNA.org預測miR-22-3p靶基因，并精確預測miRNA可識別得潛在靶位點。使用TIANamp基因組DNA試劑盒提取RASMCs的DNA。利用含有miR-22-3p結合位點的NK1R 3′UTR野生型序列(NK1R-3′-UTR-wt)和突變的NK1R的3′-UTR序列(NK1R-3′-UTR-mut)構建熒光素酶報告載體，并將其轉染到RASMCs中。使用熒光素酶報告基因測定試劑盒檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 模型組與對照組幼年大鼠氣道壁結構的病理變化 每次OVA暴露后，模型組中的所有幼年大鼠均表現出煩躁、咳嗽、頻繁抓撓、呼吸急促等癥狀。大鼠連續暴露幾天后，模型組幼年大鼠的反應較對照組慢。老鼠皮毛的顏色變暗。在大鼠肺組織切片中，HE染色顯示藍黑色核和淡紅色細胞質(見圖1)。模型組表現出更多氣道壁和氣道平滑肌增厚和不均勻的細胞排列。對照組氣道壁結構未見病理變化。模型組支氣管壁厚度(WA/Pi2)、支氣管壁平滑肌厚度(S/Pi2)及支氣管壁中平滑肌細胞的數量(N/S)高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 對照組與模型組WA/Pi2、S/Pi2、N/S比較Table 1 Comparison of WA/Pi2,S/Pi2,N/S between control group and model group

2.2 哮喘大鼠中miR-22-3p表達變化 與對照組比較，模型組的miR-22-3p的表達水平明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 對照組和模型組大鼠氣道組織中miR-22-3p的表達水平Figure 2 The expression level of miR-22-3p in the airway tissues of control group and model group注：A.miR-22-3p的表達水平變化點狀圖;B.miR-22-3p的表達水平變化熱圖。與對照組相比，①P<0.01

2.3 NK1R是miR-22-3p的靶基因 NK1R mRNA 3′-UTR區域和miR-22-3p的序列具有結合位點(見圖3A)。mimic對Mut-NK1R的熒光素酶活性的影響差異無統計學意義(P>0.05)，mimic降低了wt-NK1R的熒光素酶活性強度，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖3B。

圖3 使用熒光素酶報告基因實驗驗證NK1R mRNA的3′UTR和miR-22-3p的直接結合關系Figure 3 The luciferase reporter gene experiment was used to verify the direct binding relationship between 3′UTR of NK1R mRNA and miR-22-3p注：A.NK1R mRNA的3′UTR和miR-22-3p預測的結合位點；B.熒光素酶報告基因實驗觀察熒光素酶活性變化。與對照組比較，①P<0.01

2.4 NK1R在幼年哮喘大鼠氣道組織中的表達變化 通過RT-qPCR、Western blot分析每組大鼠氣道組織中NK1R的表達變化。與對照組相比，模型組的NK1R的mRNA和蛋白表達水平明顯上調，差異均有統計學意義(P<0.01，P<0.05)，見圖4A～D。

圖4 對照組和模型組大鼠氣道組織中NK1R的表達水平Figure 4 The expression level of NK1R in the airway tissue of control group and model group注：A.NK1R mRNA表達水平變化的點狀圖;B.NK1R mRNA表達水平變化的熱圖;C.NK1R的蛋白條帶；D.NK1R蛋白表達水平變化的柱形圖。與對照組相比，①P<0.01；與對照組相比，②P<0.05

2.5 miR-22-3p體內調節NK1R的蛋白表達水平 明確miR-22-3p對NK1R表達的調節作用，mimc下調模型組中NK1R的mRNA水平，各組差異均有統計學意義(P<0.05)；inhibitor上調模型組中NK1RmRNA水平，各組差異均有統計學意義(P<0.05)(見圖5A)。mimc下調模型組中NK1R的蛋白水平，各組差異均有統計學意義(P<0.05)；inhibitor上調模型組中NK1R的蛋白水平，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5B、圖5C。

圖5 體內驗證miR-22-3p沉默對NK1R表達的調節作用Figure 5 In vivo verification of the regulatory effect of miR-22-3p silencing on NK1R expression注：A.NK1R mRNA表達水平變化的柱形圖;B.NK1R的蛋白條帶；C.NK1R蛋白表達水平變化的柱形圖。與模型+mimic-NC組相比，①P<0.05；與模型+inhibitor-NC組相比，②P<0.05

3 討論

小兒哮喘給家庭和社會造成了巨大精神和經濟負擔，因此需要深入探究小兒哮喘的發生機制[19]。最近研究表明，感覺神經肽例如SP、NKA、NKB及降鈣素基因相關肽與肺部疾病和癌癥有關[20-21]。因此，探索感覺神經肽在氣道重塑中的分子調節機制對于研究潛在的小兒哮喘治療靶點至關重要。

通過利用幼年大鼠實驗性慢性哮喘，結果顯示miR-22-3p的表達與哮喘之間可能具有關聯。目前研究[7]表明，多種miRNA的表達水平與哮喘和氣道炎癥有關。包括miR-21、miR-223、miR-22-3p。研究[22]表明，miR-26a在ASMC肥大中起調節作用，這是氣道重塑發展中的關鍵過程。此外miR-221抑制哮喘患者的ASMC過度增殖[23]。miR-22-3p在維持心肌肥厚和組織重構中扮演重要作用[24]。本研究中miR-22-3p的表達在幼年大鼠哮喘發生過程中降低，因此可能與哮喘的發展具有密切關系。miR-22-3p可調節多種細胞增殖，包括視網膜母細胞瘤細胞[25]、肺腺癌[26]、動脈平滑肌細胞[27]。但很少有研究調查miR-22-3p在幼年哮喘模型中的表達和下游調節靶點。

本研究中通過生物信息學預測出miR-22-3p和NK1R mRNA的3′-UTR區存在潛在的靶向調節位點。以往研究表明，NK1R表達于呼吸道中的不同部位，包括氣道平滑肌、粘膜下腺、血管內皮、炎性細胞[15,28]。新的研究表明，在哮喘氣道重建過程中，NK1R可通過增加微管蛋白的表達促進大鼠氣道平滑肌細胞的遷移，表明NK1R可能是預防和控制哮喘氣道重塑的新靶標[28]。本研究進一步探究miR-22-3p與神經肽NK1R表達之間的關系，結果表明在哮喘大鼠中，miR-22-3p和NK1R的表達趨勢相反，而且表明miR-22-3p可直接抑制氣道組織中神經肽NK1R的表達。首先在體外的熒光素酶報告基因研究結果表明，在RASMCs細胞中，miR-22-3p能直接與NK1R mRNA的3′-UTR結合，通過靶向抑制降低NK1R的蛋白表達。另外，在幼年哮喘大鼠體內實驗中，我們通過注射mimics在氣道組織中過表達miR-22-3p，結果發現NK1R的表達受到明顯抑制，而通過inhibitor可以明顯抑制miR-22-3p及可以明顯上調NK1R的表達。一項研究同樣表明，miR-22能夠靶向抑制NK1R，并且因此負調節乳腺癌細胞的增殖、侵襲、遷移[12]。因此，在幼年哮喘大鼠的氣道組織中miR-22-3p可以靶向抑制NK1R，從而可能通過調節平滑肌細胞和炎性細胞的增殖，以及平滑肌細胞遷移。

4 結論

本研究結果表明，在幼年哮喘大鼠的氣道組織中，miR-22-3p可以靶向抑制NIK1R的表達，此調節機制在哮喘大鼠氣道重塑過程中可能扮演重要作用。miR-22-3p以及NK1R在肺組織中的表達特征對哮喘的早期診斷有潛在的應用價值。但仍需擴大樣本量深入研究，以確定miR-22-3p/NK1R信號發揮作用的具體機制。