中度退化草地補播10年后土壤微生物特征研究

趙文，尹亞麗,2，李世雄,2*，劉燕，劉晶晶，張如秀

1. 青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016；2.青海大學/三江源區高寒草地生態教育部重點實驗室，青海 西寧 810016；3. 青海省西寧市湟源縣畜牧獸醫站，青海 湟源 812100

草地是中國重要的陸地生態系統，也是分布最廣泛，物種最豐富的植被類型，在涵養水源、水土保持和物質循環等方面發揮著重要作用（肖桐等，2013；Katherine et al.，2019）。高寒草甸是草地生態系統的組成部分，其牧草資源不僅對當地畜牧業和民族經濟的發展具有不可代替的作用，也對高寒地區風沙、水蝕、鹽堿、內澇、地下水位變化、土壤侵蝕、土地資源的流失等自然災害的發生具有一定的屏障作用（趙春紅等，2013）。近幾十年，三江源區高寒草甸發生不同程度的退化，部分草地退化嚴重，形成黑土灘退化草地（馬玉壽等，2002）。國內生態學者長期致力于草地退化研究，并依據退化程度制定了重度退化草地翻耕建植人工草地、中度退化草地免耕補播施肥、輕度退化草地圍封禁牧等為主的分類恢復措施（閆曉紅等，2020）。其中，免耕補播利用牧草施肥和補播的聯合機組作業，通過劃破草皮，增加了土壤透水、通氣性，促進牧草生長、發育及土壤有機質分解，為植物提供更多營養物質（李小龍等，2020）。同時減輕對原生草地植被的破壞，在草群中補播優質牧草，以提高草地生產力（孫磊等，2009），但草甸退化一經出現，恢復將是一個漫長的過程（張騫等，2019）。

微生物是土壤生態系統的重要組成，參與碳、氮循環，有機化合物分解，能量傳輸、運送等多種過程，對維持生態系統穩定和可持續性方面有重要的作用（Slaughter et al.，2015）。以Biolog微孔板碳源利用為基礎的分析是微生物群落代謝功能多樣性的一種簡單、快速的方法，對不同環境中微生物群落功能多樣性信息具有重要意義（刁嬋等，2019）。從微生物的層面探究草地退化及恢復過程中的問題，可清晰明確草地退化及其恢復機理。補播做為一種草地改良措施，其目的主要為增加退化草地植被中的優良牧草；而補播對草地土壤微生物的影響滯后于對植被的影響。張建貴等（2017）研究表明補播+圍欄半年的退化高寒草甸比圍欄封育的效果更好，能夠大幅度提高土壤微生物數量；李曉娜等（2019）研究了補播1年的荒灘地，發現補播顯著改善了土壤物理性質，并對土壤微生物群落結構產生影響；姚鳳嬌等（2015）研究表明，補播草地顯著提高了土壤0—10 cm土層中真菌、細菌和放線菌的數量，并隨著修復年限的增加而呈現增加趨勢。但大多數研究針對的是短周期補播，短期補播可能會對草地生產力和微生物區系產生積極影響，課題組成員研究發現，補播短期內顯著提高了中度退化草地的生產力（楊增增等，2018）。然而，補播對中度退化草地是否產生長遠的影響仍為未知。本研究選擇研究補播較長時間（10 a）的中度退化草地，擬揭示補播年限對中度退化高寒草地的土壤微生物的影響，以期對中度退化草地恢復管理提供一定的數據基礎。

1 試驗地區與方法

1.1 試驗區概況

研究區位于青藏高原腹地的青海省果洛藏族自治州瑪沁縣大武鎮（34°27′56.9″N ，100°13′56.9″W，海拔3740 m左右）。該地區為高原大陸性氣候，高寒缺氧，日照時間短，太陽輻射強且晝夜溫差大。1967—2017年平均氣溫在-3.4—3.0 ℃之間，最高氣溫為 26.6 ℃，最低氣溫-34.9 ℃，最大溫差22.4 ℃，最冷月和最熱月平均溫度分別為-12.6 ℃和9.7 ℃，全年無絕對無霜期（洪卓華等，2018）。降水集中在5—9月，年降水量513—542 mm，年蒸發量為1160 mm。牧草生長季為 156 d，高寒草甸是該地區主要的草地類型，未退化高寒草甸優勢種為高山嵩草（Kobresia pygmeae），主要的伴生種有為垂穗披堿草（Elymus nutans）、美麗風毛菊（Saussurea superba）等。

1.2 試驗方法

參照馬玉壽等（2008）的退化草地分類標準，2006年在青海省果洛州大武鎮用免耕補播聯合作業機對中度退化草地進行免耕補播處理。選擇適宜草種是保證補播效果的關鍵。本課題組經多年馴化選育的根莖型鄉土草種——青海草地早熟禾（Poa pratensisL.）不僅具有適口性好、耐牧的特點，同時可快速形成草皮層，是高寒地區退化草地快速恢復的優良牧草（楊慧茹，2012）。研究表明補播早熟禾第二年的草地植被蓋度、生物量、禾草的比例顯著增加（李苗，2016）。因此，選擇優質禾草青海草地早熟禾為補播草種，播種量 3.75 kg·hm-2；并施用尿素（150 kg·hm-2），補播總面積約20 hm2。自補播后未進行后續改良，返青期（4—6月）完全禁牧，冬季放牧利用（每年12月至次年4月）。

2017年8月，選擇補播10年及相鄰的未補播的中度退化草地各10 hm2（表1）作為試驗樣地，在補播草地及未補播草地（對照）各選擇植被均勻、具有代表性的區域設置10 m×20 m試驗小區，小區間隔100 m，4次重復。在每小區隨機選取4個面積為50 cm×50 cm的樣方，對植被群落特征進行調查。采用蛇形取樣法，以直徑3.5 cm的土鉆在各小區采集0—10 cm和10—20 cm土樣，每小區5—8鉆分層混合為1個土樣，過2 mm篩，撿除枯物、石粒及植物根系等，封裝在自封袋，夾棉塞，冰盒取回4 ℃保存，一周內分析測試微生物生物量碳、氮、群落多樣性及碳源利用（黨雯等，2015）。

1.3 微生物群落多樣性分析方法

采用Biolog-Eco分析土壤微生物6類碳源利用能力。

（1）AWCD為平均每孔顏色變化率（average well change devolopment），是表征土壤微生物活性和多樣性的一個重要指標，其值可以反映微生物對單一碳源的利用能力，計算式為（金映虹等，2017）：

式中，C為31孔反映孔在590 nm下的吸光值；R為對照孔吸光值；n為碳源種類數31；C-R的值均大于或等于0，C-R小于0的計算中將其記為0。

（2）選擇Shannon多樣性指數（H指數）估算群落多樣性：

式中，Pi為每個孔吸光度/所有吸光度之和。

（3）Simpson優勢度指數（D指數），反映了群落中最常見的物種，可評估微生物群落優勢度：

式中，Pi為每個孔吸光度/所有吸光度之和。

表1 試驗樣地Table 1 Introduction of test site

1.4 數據處理

運用Microsoft Excel 2013進行數據整理；運用SPSS 20.0對各個試驗小區的植被地上、地下生物量、微生物生物量及微生物多樣性指數進行獨立樣本t檢驗，顯著水平α=0.05，表中的數據均為平均值±標準差；運用SigmaPlot 14.0作圖。

2 結果分析

2.1 補播草地植被生物量變化特征

對補播 10年后和中度退化草地植被地上、地下生物量進行分析，補播 10年后和中度退化草地植被地下生物量分別為 19.61 kg·m-3和 20.12 kg·m-3，地上生物量分別為 200.95 g·m-2和 136.05 g·m-2，但是在95%置信區間補播10年后和中度退化草地間均無顯著差異（P＞0.05）（圖1）。

2.2 土壤微生物量特征

對補播 10年和中度退化草地不同土層土壤微生物量碳、氮進行分析，0—10 cm土層的微生物量碳、氮均高于10—20 cm土層（圖2），即0—20 cm的土層中，75%以上的土壤微生物分布在0—10 cm土層中。而微生物量氮在0—10 cm和10—20 cm表現為補播 10年草地顯著高于中度退化草地（P＜0.05）；微生物量碳在0—10 cm和10—20 cm土層均表現為補播 10年草地最高，但與中度退化草地無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 土壤微生物群落多樣性

研究發現，0—10 cm和10—20 cm土層補播10年草地AWCD大于中度退化草地（圖3），微生物碳源利用率隨培養時間逐漸升高。0—10 cm土層補播10年和中度退化在培養1—4 d，AWCD增長迅速，4 d后增長速率變緩。獨立樣本t檢驗分析顯示，培養第7天補播10年和中度退化草地AWCD無顯著差異（P＞0.05）（表2）。10—20 cm土層中中度退化和補播 10年草地的碳源利用率隨時間呈現線性增長，且培養第7天時補播10年草地AWCD顯著高于中度退化草地（P＜0.05）。

圖1 草地植被地上（Ba）、地下生物量（Bu）Fig. 1 Effects of reseeding on above (Ba) and underground (Bu) biomass of degraded grassland vegetation

圖2 土壤微生物生物量碳、氮的分布特征Fig. 2 Distribution characteristics of soil microbial biomass carbon and nitrogen

圖3 土壤微生物平均顏色變化率（AWCD）Fig. 3 Average color change rate of soil microorganisms (AWCD)

表2 培養第7天土壤微生物多樣性指數Table 2 Soil microbial diversity index at day 7 of cultivation

對補播10年草地和中度退化草地的H和D進行分析（圖4），0—10 cm和10—20 cm的土層補播10年草地H和D略高于中度退化草地，且H和D隨培養時間逐漸升高。0—10 cm土層中補播10年和中度退化草地的H指數在培養1—3 d增長迅速，培養3 d后增長速率變緩，培養5 d趨于平緩，培養7 d兩處理無顯著差異（P＞0.05）（表2）；10—20 cm的土層中補播10年和中度退化草地H指數在培養1—3 d增長較為迅速，培養3 d后增長速率變緩，且培養7 d補播10年草地顯著高于中度退化草地（P＜0.05）。0—10 cm土層中補播10年和中度退化草地D指數在培養1—3 d增長迅速，培養 3 d趨于平緩，培養 7 d兩處理無顯著差異（P＞0.05）；10—20 cm土層中補播10年和中度退化草地D指數在培養1—2 d增長迅速，培養2 d后增長速率變緩并趨于平衡，培養7 d兩處理無顯著差異（P＜0.05）。

2.4 土壤微生物對6類碳源利用能力分析

圖4 土壤微生物Shannon指數（H）及Simpson指數（D）Fig. 4 Shannon (H) and Simpson index (D) of soil microorganisms

圖5 草地土壤微生物對6類碳源利用率Fig. 5 Utilization rate of 6 types of carbon sources by soil microorganisms

培養7 d，中度退化草地和補播10年草地6大類碳源利用能力表現差異（圖5）。0—10 cm中度退化草地土壤碳源利用表現為氨基酸＞單糖類＞胺類＞酯類＞酸類＞醇類的利用，補播 10年草地單糖類＞氨基酸＞酯類＞胺類＞醇類＞酸類，其中補播 10年草地單糖利用占比顯著高于中度退化草地；其他碳源利用變化差異不顯著。10—20 cm中度退化草地中碳源利用表現為氨基酸＞胺類＞酯類＞單糖＞酸類＞醇類，補播10年后草地氨基酸＞酯類＞胺類＞酸類＞醇類＞單糖，其中單糖和酯類利用占比差異顯著，補播 10年草地單糖利用占比顯著高于中度退化草地，而酯類顯著低于中度退化草地。

2.5 微生物對六類碳源利用特征分析

本試驗選取補播10年和中度退化草地0—10 cm土層作進一步的碳源選擇利用分析。補播 10年草地碳源利用數據提取2個主成分，累計貢獻率達到93.41%，其中第一軸主成分（PCA1）方差貢獻率為66.83%，第二主成分（PCA2）的方差貢獻率為26.58%（圖6A）；而中度退化草地第一、二累計方差貢獻為97.87%（圖6B），這說明未退化草地對碳源選擇利用較集中和穩定。六類碳源的主成分矩陣顯示（表 3、4），不同處理微生物群落在兩個培養期對碳源選擇利用以氨基酸類為主導碳源。

表3 補播10年草地0—10 cm土壤微生物對6類碳源利用主成分矩陣Table 3 Component matrix of the six type of carbon sources by 0-10 cm soil microorganisms in grassland after 10 years of reseeding

表4 未補播草地0—10 cm土壤微生物對6類碳源的主成分矩陣Table 4 Component matrix of the six type of carbon sources by 0-10 cm soil microorganisms in grassland of never reseeded

2.6 補播草地土壤微生物生物量與群落多樣性的相關性分析

土壤微生物平均顏色變化率（AWCD）與微生物生物量碳呈極顯著正相關（P＜0.01）（表 5），與微生物生物量氮呈極顯著正相關（P＜0.05）；多樣性H和D指數與微生物生物量碳、氮都呈現出極顯著正相關（P＜0.01），其中微生物量氮與多樣性D指數相關系數最大。

圖6 中度退化（A）、補播10年草地（B）微生物對6類碳源代謝的主成分圖Fig. 6 Principal component analysis of 6 types of carbon sources by microorganisms in moderately degraded grassland (A) and grassland after 10 years of reseeding (B)

表5 土壤微生物AWCD、H指數、D指數和微生物生物量碳、氮相關系數Table 5 Correlation coefficients of soil microorganism AWCD, H index and D index with microbial biomass carbon, nitrogen

3 討論

補播以近自然的措施在短期內顯著提高草地生產力，石鋒（2009）對草地碳庫研究指出，補播會顯著影響草地碳庫，具體表現在對土壤質量的改善和地上生物量的增加。本研究發現在中度退化高寒草甸補播青海草地早熟禾 10年對植被地上、下生物量無顯著影響（P＞0.05），這可能與補播周期有關，補播初期新增加的物種還未得到完全生長，有些種子還處于萌發的狀態，隨著補播年限的增加，草地生產力達到最大值，之后隨著管理水平等的降低草地生產力會逐漸降低。另一方面，補播草地不同于天然草地，其生態和生產功能難以長時間維持平衡，同時補播使禾草增加，影響了原生植被種間競爭關系，使得總物種數減少，草地可食牧草比例增加（陳子萱等，2011）。有研究指出補播 2年后植被地上生物量顯著高于退化草地（孫磊等，2012），2—4年內補播草地的地上生物量會達到最大（李希來等，2018），而此后由于環境因素和種間競爭等關系復雜，群落可能出現演替不確定性。

微生物生物量被稱為活的有機質，其大小是判定土壤肥力高低及其變化的重要依據，可作為非穩定性有機碳的指示器反映有效養分的狀況和生物活性的變化（Rui et al.，2011）。本研究發現，補播10年后，微生物量碳與未補播草地無顯著差異，表明補播 10年后補播措施的影響基本消失。補播后微生物的數量及其多樣性可能是短期內增加（3—5年），隨著管理水平等措施的下降微生物區系也出現下降的趨勢。姬萬忠等（2016）在天祝對補播3年的退化高寒草甸的研究發現，與沒有補播的草地相比，補播草地土壤微生物量C和N分別增加了23.50%和50.78%，說明補播初期對退化草地土壤微生物有一定的影響。邵建飛（2009）研究指出，補播3年的草地土壤微生物生物量C、N含量顯著高于補播6年草地，建議3—4年后再次進行補播。因此補播草地的微生物生物量在 1—3年是增加的趨勢，但是隨著補播年限的增加補播影響會減弱甚至消失。

微生物群落的 AWCD既反映了微生物對碳源的整體利用水平，也可以衡量31種碳源利用程度，能夠簡便分析出微生物群落碳源利用的動力學特征（陳喜蓉等，2017）。本研究中補播和中度退化草地 AWCD均隨培養時間呈緩慢上升趨勢。這說明試驗樣地缺乏有效的碳源營養物質，樣地整體呈現退化的狀態，微生物群落處于較低代謝活力的狀態（馮海瑋等，2016），單一碳源就能夠激發處理土樣中微生物代謝活力，并慢慢趨于平緩。而本研究的主要目的是比較分析補播和中度退化草地的微生物，補播和中度退化草地0—10 cm土壤微生物對碳源利用能力差異不顯著，補播 10年后對中度退化草地土壤微生物區系的擾動影響基本消失。相關性分析顯示AWCD與微生物生物量C、N極顯著正相關，說明環境中碳源越豐度越有利于土壤微生物生物量的積累，土壤微生物碳氮磷存在明顯的“Redfield Ratio”效應，即土壤微生物生物量的化學計量比是嚴格定義的，微生物生物量養分比率存在動態平衡控制（Cory et al.，2007），土壤微生物通過調節自身生理特性來應對環境變化（Allison et al.，2010），即微生物生物量C∶N達到一定的比例后才能進行碳氮的轉化循環。H和D指數用來估算種群多樣性高低和微生物群落的優勢度（柳炳俊等，2020）。本研究中補播草地的微生物多樣性和均勻度均高于中度退化草地，但差異并不顯著（P＞0.05），尤其是0—10 cm土層未表現任何差異，而微生物的80%集中在近表層（0—10 cm土層）（趙文等，2020）。總體上，微生物的區系并沒有在補播10年后發生改變，這與陳子萱等（2011）的研究一致，認為補播只是改良措施的一種，不會對草地的退化有本質的改變，也不能使得退化草地得到恢復或逆向演替，只是一種短期內提高草地生產力的措施。同時土壤碳源是影響土壤微生物群落動態的重要因素，可根據土壤微生物對不同類型碳源的相對利用程度，反映微生物的代謝功能類群（張紅等，2014；趙輕舟等，2018）。本研究碳源利用顯示，中度退化草地補播后碳源利用發生改變，單個碳源利用能力在兩草地間無顯著差異（P＞0.05），進一步碳源利用主成分分析顯示，補播和中度退化草地近表層土壤微生物主要利用氨基酸類碳源，進一步說明補播10年后，補播效果逐漸消失。

4 結論

在中度退化草地進行補播恢復措施，發現補播10年后草地的植被上和地下生物量、微生物生物量碳、土壤微生物多樣性指數AWCD、H指數、D指數和碳源利用能力與未補播草地差異不顯著（P＞0.05）。即補播10年后草地與未補播草地基本一致，補播效果消失。