富集膠體晶體用于飲用水中痕量阿特拉津的測定

夏緩，吳蘊(yùn)棠，孫忠，徐蓓，劉茜，賽娜

（天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，天津 300070）

阿特拉津（atrazine）是世界范圍內(nèi)廣泛使用的一種三嗪類除草劑。它主要適用于苗前土壤處理和苗后早期莖葉兼土壤噴霧處理，可防除一年生禾本科雜草，對某些多年生雜草也有一定的抑制作用。自1959年投入使用以來，國內(nèi)外使用阿特拉津已有60多年歷史，曾被認(rèn)為是生態(tài)安全的除草劑[1]。但隨著對阿特拉津毒理學(xué)研究的深入，阿特拉津?qū)Νh(huán)境、動物以及人類的危害逐漸被人們所認(rèn)知。研究表明，低濃度阿特拉津長期暴露會對人畜的內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾，引發(fā)一系列病癥，甚至致畸、突變、致癌。阿特拉津也可對眼睛和皮膚有刺激作用，可經(jīng)口、皮膚等部位進(jìn)入血液循環(huán)，使肝腎、心臟、血管出現(xiàn)中毒癥狀，破壞人類心血管、生殖系統(tǒng)，嚴(yán)重危害人體健康[2-4]。

由于阿特拉津具有較大的極性，在環(huán)境中較為穩(wěn)定，殘留期長，可蓄積并隨著地表徑流、沉降等多種途徑污染地表水和地下水。目前多個國家（包括中國、美國、日本等）已在地表水和地下水中發(fā)現(xiàn)阿特拉津殘留[5]。因此，阿特拉津已被我國列入水中優(yōu)先控制的污染物之一。1986年，歐盟將阿特拉津列為飲用水中檢測標(biāo)準(zhǔn)之一，即其含量不得超過0.1 μg/L。1994年，美國環(huán)境保護(hù)局規(guī)定阿特拉津在水中的最高允許濃度為3 μg/L。我國GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定阿特拉津的標(biāo)準(zhǔn)限值為3 ng/mL[6-7]。

關(guān)于水質(zhì)中阿特拉津測定，國外多采用色譜法、色質(zhì)聯(lián)用法等進(jìn)行測定。國內(nèi)新修訂的GB/T 5750.8—2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法》采用固相萃取/氣相色譜-質(zhì)譜法對阿特拉津進(jìn)行分析。衛(wèi)生部衛(wèi)生監(jiān)督司編寫的GB/T 16336—1996《食品中的阿特拉津殘留量的測定》中使用氣相色譜法測定。國家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)制定了HJ 587—2010《水質(zhì)阿特拉津的測定高效液相色譜法》。但這些方法需要的設(shè)備昂貴，操作繁瑣，難以進(jìn)行快速測定和現(xiàn)場監(jiān)測[8-10]。因此，發(fā)展一種簡單、成本低、高靈敏度的檢測方法十分必要。

膠體晶體是20世紀(jì)90年代中期提出的新概念和新型人工光學(xué)材料。膠體晶體是由單分散的、直徑在微米或亞微米級別的無機(jī)或有機(jī)膠體顆粒，在重力、靜電力或毛細(xì)管力等作用下組裝形成的2D或3D有序陣列結(jié)構(gòu)[11]。由于膠體晶體具有光傳播控制特性而使得它在傳感器、臨床診斷、生物醫(yī)學(xué)等諸多方面有著廣闊的應(yīng)用前景[12-13]。自Asher等通過共價鍵分子印跡修飾膠體晶體表面用于葡萄糖檢測以來[14]，膠體晶體與分子印跡技術(shù)結(jié)合研發(fā)出多種材料用于金屬離子、農(nóng)獸藥殘留、蛋白質(zhì)等的光學(xué)測定[15-18]。盡管這些膠體晶體材料表現(xiàn)出較高的檢測特異性和操作簡便性等優(yōu)勢，但其檢測靈敏度仍有待進(jìn)一步提高。近期，一些研究者發(fā)現(xiàn)，“親水-疏水”結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生富集效應(yīng)，可對目標(biāo)物進(jìn)行聚集濃縮，從而提高檢測方法的靈敏度[19-23]。

本文將阿特拉津作為檢測目標(biāo)物，將“親水-疏水”富集系統(tǒng)引入膠體晶體中，發(fā)展一種新型光學(xué)富集檢測膠體晶體材料。該材料可對痕量阿特拉津進(jìn)行富集吸附，并通過膠體晶體衍射光變化實現(xiàn)對飲用水中阿特拉津的快速、靈敏、特異性檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿特拉津、西維因、毒死蜱、三聚氰胺：三征新科技化工有限公司；甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、過硫酸鉀、過硫酸銨、氯化鈉、甲醇（色譜級）：天津大學(xué)科威公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-150恒溫水箱：寧波海曙賽福實驗儀器廠；HL-2000光纖光譜儀：美國OCEANOPTICSS公司。ESEM XL30環(huán)境掃描電鏡：Phillips公司；Waters Tm 600 E高效液相色譜儀配紫外檢測器：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 富集膠體晶體的制備

稱取30 mg阿特拉津溶于1.5 mL甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯中，超聲混合使其溶解后加入0.06 g過硫酸鉀和15 mL去離子水超聲混合均勻，N2吹10 min后，移入四口燒瓶中，在氮氣的保護(hù)下80℃攪拌反應(yīng)。將所得乳液冷卻至25℃，產(chǎn)物溶液通過離心除去上清液，經(jīng)多次用去離子水振蕩超聲分散后，即可得到單分散膠體顆粒乳液。將其與140 mL去離子水混合，超聲30 min，灌入附有載玻片的玻璃器皿中，放置在恒溫恒濕箱內(nèi)（溫度：30℃，濕度：46%）。

同時，將10 g丙烯酰胺、2.2 g甲叉丙烯酰胺和50 mL去離子水，室溫25℃下振蕩30 min后，加入80 mg過硫酸銨，通10 min氮氣以除去溶液中的氧氣，即可得到聚合前驅(qū)液。采用毛細(xì)力誘導(dǎo)法將其灌入陣列中，烘干60 min，用冰乙酸和甲醇混合液（1∶18，體積比）反復(fù)洗滌，再用甲醇沖洗晶體，去除過量的冰乙酸，最后形成富集膠體晶體材料。非印跡富集膠體晶體制備仍采用同樣方法，僅區(qū)別于未添加模板分子。

1.3.2 富集膠體晶體的表征與阿特拉津測定

掃描電鏡對富集膠體晶體表面形態(tài)進(jìn)行分析。利用光纖光譜儀測定吸附不同濃度阿特拉津后的富集膠體晶體布拉格衍射光譜變化。

1.3.3 飲用水樣品前處理

樣品分析以天津市和平區(qū)自來水為基質(zhì)樣品，進(jìn)行加標(biāo)檢測，每個濃度重復(fù)5次。阿特拉津加標(biāo)自來水樣品，經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后直接用于富集膠體晶體測定。將所采集的飲用水樣品置于分液漏斗中，加15 g氯化鈉和25 mL正己烷，振蕩萃取，取其上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，N2吹干，固體殘渣使用2 mL甲醇溶解，用于高效液相色譜法分析。

1.3.4 高效液相色譜法分析條件

色譜柱為 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；進(jìn)樣體積為 5 μL；流動相為甲醇-水（4∶1，體積比）混合液；流速為0.6 mL/min；檢測波長為220 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)采用軟件Origin 7.5分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 富集膠體晶體的形態(tài)特征以及檢測機(jī)理

富集膠體晶體的掃描電鏡 （scanning electron microscope，SEM）圖片、結(jié)構(gòu)色與富集檢測機(jī)理見圖1。

從圖1a可以看出，所制備的富集膠體晶體呈現(xiàn)膠體顆粒粒徑均一、排布均勻、呈現(xiàn)面心立方緊密堆積結(jié)構(gòu)。這種有序晶格結(jié)構(gòu)的特殊性，可發(fā)生強(qiáng)烈的衍射效應(yīng)從而出現(xiàn)布拉格衍射峰并產(chǎn)生紫色結(jié)構(gòu)色。在垂直入射條件下，衍射峰波長的位置可用布拉格定律表示。

圖1 富集膠體晶體的形態(tài)特征及檢測機(jī)理Fig.1 Morphology and detection principle of enrichment colloidal crystals

式中：λ為衍射峰波長，nm；D為膠體顆粒間距，nm；na為膠體晶體有效折射率；θ為入射光與晶體面之間夾角，°。

Lawrence等發(fā)現(xiàn)沙漠中甲殼蟲表面具有“親水-疏水”結(jié)構(gòu)，有利于鎖住霧中的水，可起到富集濃縮的作用。因此，人工模仿具有“親水-疏水”結(jié)構(gòu)已作為一種新型有效策略，完成富集稀釋的目標(biāo)分子，并已用于提高熒光分析和等離子體納米傳感器的靈敏度[19-23]。如圖1b所示，所制備的富集膠體晶體具有疏水膠體顆粒以及周圍親水凝膠組成的“親水-疏水”結(jié)構(gòu)。其中，疏水膠體顆粒具有緊密堆積的結(jié)構(gòu)和良好的周期分布規(guī)律，空位缺陷較少，結(jié)構(gòu)完整。而環(huán)繞疏水膠體顆粒的親水凝膠具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有利于目標(biāo)分子穿梭并進(jìn)入膠體顆粒中。同時其具有柔韌和剛性，可以穩(wěn)固膠體晶體結(jié)構(gòu)的前提下，可發(fā)送一定膨脹或收縮，有利于識別信號的傳送表達(dá)。如圖1c所示，富集膠體晶體可依托其“親水-疏水”結(jié)構(gòu)增強(qiáng)其對目標(biāo)物的富集，提高檢測靈敏度。

2.2 方法的評估

2.2.1 靈敏度

分子印跡聚合物的識別性能依賴于聚合物洗脫模板分子后所留下來的孔穴立體結(jié)構(gòu)和功能團(tuán)的位置。圖2展示了富集膠體晶體和非印跡富集膠體晶體對阿特拉津的光學(xué)響應(yīng)。

如圖2a所示，當(dāng)阿特拉津濃度為2 ng/mL時，富集膠體晶體開始產(chǎn)生響應(yīng)，其布拉格衍射峰峰強(qiáng)降低2.05。隨著溶液中阿特拉津含量增加，布拉格衍射峰強(qiáng)度隨之減弱，而當(dāng)溶液中阿特拉津濃度達(dá)到32 768 ng/mL時，布拉格衍射峰強(qiáng)度降低到最低點。同時，非印跡富集膠體晶體產(chǎn)生的布拉格衍射峰并沒有隨阿特拉津濃度的改變而發(fā)生明顯變化，如圖2b中所示，在研究濃度范圍內(nèi)，富集膠體晶體對阿特拉津的吸附遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非印跡富集膠體晶體對阿特拉津的吸附，且檢測靈敏度達(dá)到2 ng/mL，已滿足我國對地表水阿特拉津的標(biāo)準(zhǔn)限值的檢測要求。造成較高的檢測靈敏度歸結(jié)于其“親水-疏水”結(jié)構(gòu)以及廣闊的比表面積，使得阿特拉津目標(biāo)分子能夠進(jìn)行濃縮和富集并廣泛地滲入材料內(nèi)部產(chǎn)生強(qiáng)烈的光學(xué)響應(yīng)。

圖2 富集膠體晶體和非印跡富集膠體晶體對阿特拉津的響應(yīng)Fig.2 Optical responses of enrichment colloidal crystals and nonimprinted enrichment colloidal crystal to atrazine

2.2.2 特異性

為研究制備的富集膠體晶體吸附選擇性，以幾種阿特拉津結(jié)構(gòu)類物（西維因和三聚氰胺）作為分析對象，進(jìn)行了特異性吸附研究，富集膠體晶體對不同目標(biāo)分子的選擇性見圖3。

從圖3a和3b可知，富集膠體晶體對西維因和三聚氰胺響應(yīng)較小或幾乎沒有響應(yīng)。進(jìn)一步將富集膠體晶體對阿特拉津、西維因和三聚氰胺的響應(yīng)性進(jìn)行對比（圖3c），可明顯得出，所制備的富集膠體晶體具有較好的響應(yīng)特異性，并進(jìn)一步確定了富集膠體晶體的選擇性來源于模板分子（阿特拉津）產(chǎn)生的納米孔穴。

圖3 富集膠體晶體對不同目標(biāo)分子的選擇性Fig.3 Selectivity of enrichment colloidal crystals to different target molecules

2.2.3 實際飲用水樣品的分析

為研究富集膠體晶體的適用性和有效性，將富集膠體晶體用于自來水樣品中阿特拉津殘留的檢測，并采用高效液相色譜方法進(jìn)行對比見表1。

由表1所示，和高效液相色譜法得到結(jié)果基本一致，其中富集膠體晶體對不同濃度的阿特拉津加標(biāo)回收率在89.0%～105.5%之間。因此，富集膠體晶體適用于實際飲用水樣品的阿特拉津檢測。

表1 富集膠體晶體以及高效液相色譜法在實際飲用水樣品檢測中的應(yīng)用Table 1 Application of enrichment colloidal crystals and high performance liquid chromatography（HPLC）in actual water sample detection

2.2.4 富集膠體晶體響應(yīng)時間

富集膠體晶體的周期性結(jié)構(gòu)除了能提供可讀的光信號外，還提供較為廣闊的比表面積。比表面積增大，使更多識別位點處于表面上，有利于與外來目標(biāo)分子相結(jié)合，達(dá)到快速響應(yīng)的目的。圖4是以時間驅(qū)動模式測定的富集膠體晶體響應(yīng)時間曲線。

圖4 富集膠體晶體對阿特拉津（500 ng/mL）檢測響應(yīng)時間Fig.4 The response time of enrichment colloidal crystals to atrazine（500 ng/mL）

從圖4可以看出，富集膠體晶體對阿特拉津響應(yīng)時間僅為7 min左右。相比高效液相色譜法、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫法等傳統(tǒng)檢測方法，富集膠體晶體縮短了檢測時間和預(yù)處理時間。富集膠體晶體表現(xiàn)出的較快檢測時間可能與其特殊結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，即其均質(zhì)陣列層可使目標(biāo)物順暢地擴(kuò)散到富集膠體晶體內(nèi)部，而且其高比表面積和特殊的“親水-疏水”結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步促進(jìn)其從表面擴(kuò)散到材料內(nèi)部進(jìn)行響應(yīng)檢測。

3 結(jié)論

本文以阿特拉津為靶標(biāo)物，研發(fā)出一種新型光學(xué)檢測材料——富集膠體晶體。該材料具有由疏水膠體顆粒與親水凝膠構(gòu)成的“親水-疏水”結(jié)構(gòu)，可以對目標(biāo)物進(jìn)行富集并通過布拉格衍射峰強(qiáng)度變化實現(xiàn)對阿特拉津目標(biāo)物識別檢測。該富集膠體晶體表現(xiàn)出較高的檢測靈敏度，穩(wěn)定性和較強(qiáng)的識別特異性，對于飲用水目標(biāo)分析的回收率可達(dá)到89.0%～105.5%，分離效率較高。同時，相對于傳統(tǒng)檢測方法（如高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法等），該富集膠體晶體具有低成本、易操作、無需昂貴儀器以及較快的檢測響應(yīng)性，呈現(xiàn)出較為廣闊的應(yīng)用前景。下一步研究需集中在深入挖掘該納米材料的結(jié)構(gòu)特異性，結(jié)合其它檢測技術(shù)以進(jìn)一步增強(qiáng)其檢測靈敏度和穩(wěn)定性。