酸棗仁蛋白酶解產物功能特性及抗疲勞活性研究

韓榮欣，張紅印，沈穎昕，范琳，邵帥，衣春光，嚴銘銘

（長春中醫藥大學，吉林 長春 130117）

酸棗仁為鼠李科植物酸棗[Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）HuexH.F.Chou]的干燥成熟種子，具有養心補肝、寧心安神、斂汗生津的功效[1]，是鎮靜安神的良藥。現代藥理學研究表明酸棗仁具有鎮靜、抗驚厥、抗炎以及抗腫瘤等作用[2]。作為衛生部所認證的藥食同源食品，酸棗仁中富含皂苷、黃酮、生物堿、脂肪酸以及蛋白質等成分，其中皂苷類、黃酮類成分被認為是發揮鎮靜催眠作用的主要成分，已得到了廣泛研究[3-4]。據文獻報道，酸棗仁中蛋白質成分高達40%，包含18種人體所需的氨基酸，可作為保健食品中的蛋白質來源，具有較好的研究前景[5-6]。

近年來食源性植物蛋白因其具有抗氧化、降血壓、抗菌以及增強免疫功能等生物活性得到廣泛關注，但由于蛋白質的分子量較大，空間結構復雜，人體攝入后不容易被消化吸收，難以有效發揮其營養價值。采用酶解法對蛋白質進行改性處理，可使蛋白質轉化為具有適宜分子大小、電荷分布的肽類，反應條件溫和、專一性強、不影響蛋白質的營養價值。相關研究表明，蛋白質的酶解產物具有比蛋白質更好的功能特性（如乳化性、起泡性和溶解性等[7-9）]，同時也有研究發現蛋白酶解物具有良好的生物活性（如抗氧化活性[10]、免疫活性[11]、降血壓活性[12]、抗疲勞活性[13]等），酶解法已成為蛋白質改性研究的熱點方向。

疲勞已經成為亞健康的主要表現而得到人們的重視，目前已有研究從動植物中提取出多種具有抗疲勞作用的多肽，抗疲勞肽不僅可提供人體所需氨基酸，還具有增強機體抗氧化能力等優點，已成為抗疲勞研究領域的熱點[14]。目前國內外對于酸棗仁蛋白的研究多集中于蛋白提取工藝和氨基酸組成分析，尚未有對酸棗仁蛋白酶解產物功能特性的報道，本研究將對酸棗仁蛋白酶解處理，研究酶解產物的功能特性和抗疲勞活性，為擴展酸棗仁藥材研究領域以及酸棗仁蛋白酶解產物在保健食品行業中的應用發展提供參考依據。

1 試劑與儀器

1.1 藥材與試劑

酸棗仁藥材：安徽亳州藥材市場；堿性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；血清尿素氮、血乳酸、肝糖原、肌糖原、乳酸脫氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛、Na+-K+-三磷酸腺苷酶檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器設備

HX-400A型高速中藥粉碎機：浙江省永康市溪岸五金藥具廠；HH-6數顯恒溫水浴鍋：金壇市佳美儀器有限公司；DF-101S集熱式磁力攪拌器：金壇市醫療器械廠；DZF-6050型真空干燥箱：上海博迅實業有限公司；UV-1700紫外分光光度計：日本島津（中國）有限公司；AB135-S電子分析天平：梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；HZP-L502數字型pH計：福州華志科學儀器有限公司；5804R低溫離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司；SCIENTZ-50F冷凍干燥機：寧波新芝凍干設備股份有限公司；K9840自動凱氏定氮儀：濟南海能儀器股份有限公司。

1.3 實驗動物

6周齡～8周齡的雄性ICR小鼠，體重18 g～22 g，購于遼寧長生生物技術有限公司。

2 方法

2.1 酸棗仁藥材脫脂處理

取酸棗仁藥材，粉碎后過4號篩，置于石油醚[料液比 1 ∶5（g/mL）]中浸泡脫脂 24 h[15]，室溫 25 ℃下3 000 r/min離心10 min，沉淀在通風櫥中干燥，過4號篩，得到脫脂的酸棗仁粉末。

2.2 酸棗仁蛋白的提取

取脫脂酸棗仁粉末，按1∶25（g/mL）的料液比加入蒸餾水溶解，用1 mol/L的NaOH溶液調節溶液pH 11，57℃恒溫攪拌提取50 min，3 000 r/min離心20 min，過濾得上清液，用1 mol/L的鹽酸溶液調節溶液pH 4，置于4℃下靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，沉淀用水復溶，用1 mol/L的NaOH調節溶液pH 7，透析48 h，凍干得酸棗仁蛋白[16]。

2.3 酸棗仁蛋白的酶解

取酸棗仁蛋白，加入蒸餾水溶解配制成5%的蛋白溶液，酶占底物的質量分數為2%，分別加入堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，分別調節至最適溫度和最適pH值酶解3 h，酶解完畢后，將溶液置于90℃水浴中滅酶10 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液，凍干得酸棗仁蛋白酶解產物[9]。

2.4 最適蛋白酶的篩選

2.4.1 不同蛋白酶解產物水解度（degree of hydrolysis，DH）的測定

總氮含量：采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法進行測定。氨基酸態氮含量：采用GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態氮的測定》中的酸度計法進行測定[17]。

DH/%=（氨基酸態氮含量/總氮含量）×100

2.4.2 不同蛋白酶解產物蛋白質回收率的測定

采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法測定酸棗仁脫脂粉的蛋白質含量，采用福林酚法測定酸棗仁蛋白酶解產物中蛋白質含量，按下式計算蛋白質回收率。

蛋白質回收率/%=（酶解產物中蛋白質的質量/酸棗仁脫脂粉中蛋白質的質量）×100

2.4.3 不同蛋白酶解產物對小鼠負重游泳時間的影響

取不同蛋白酶的酶解產物，按200 mg/kg的劑量給小鼠灌胃，比較3種蛋白酶產物對小鼠負重游泳時間的影響。

2.5 功能特性測定

2.5.1 溶解性

取酸棗仁蛋白酶解產物加蒸餾水制備成1%的溶液，分別調節溶液pH值（2～12）后，5 000 r/min離心15 min，取上清液，用福林酚法分別測定上清液和樣品溶液中的蛋白質含量[18]。

溶解性計算公式：溶解性/%=（上清液中蛋白質含量/樣品中蛋白質含量）×100

2.5.2 持水性

取0.5 g酸棗仁蛋白酶解產物，置于10 mL刻度離心管中，加入10 mL蒸餾水，攪拌混合1 min，使樣品均勻分散在水中，不同溫度（20、40、60、80、100 ℃）水浴加熱30 min，4 000 r/min離心20 min，去除上清液，稱量刻度離心管質量[19]。

持水性計算公式：持水性/（g/g）=（m2-m1）/m0

式中：m0為樣品質量，g；m1為樣品質量+離心管質量，g；m2為去除上清液后的樣品質量+離心管質量，g。

2.5.3 吸油性

取0.5 g酸棗仁蛋白酶解產物，置于10 mL離心管中，加入大豆色拉油3 mL，將樣品與色拉油混勻，不同溫度下（20、40、60、80、100 ℃）靜置 1 h，4 000 r/min 離心20 min，吸取上層未被吸附的色拉油，稱量質量[19]。

吸油性計算公式：吸油性/（g/g）=（m2-m1）/m0

式中：m0為樣品質量，g；m1為樣品質量+離心管質量，g；m2為吸油后的樣品質量+離心管質量，g。

2.5.4 起泡性及起泡穩定性

配制1%的酸棗仁蛋白酶解產物樣品溶液50 mL，調節不同梯度的pH值（2～12），記錄體積V0，置于高速分散器中10 000 r/min攪打1 min，記錄總體積V1，靜置30 min后再次記錄其總體積V2，按下式計算起泡性和起泡穩定性[20]。

起泡性/%=（V1-V0/V0）×100

起泡穩定性/%=[（V2-V0）/（V1-V0）]×100

2.5.5 乳化性（emulsifying activity index，EAI）及乳化穩定性（emulsion stability index，ESI）

配制0.1%的酸棗仁蛋白酶解產物樣品溶液9 mL，調節不同梯度的pH值（2～12），加入3 mL大豆色拉油，10 000 r/min高速均質2 min，形成均一的乳化液，取50 μL于試管中，再加入5 mL 0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液，于500nm處測定吸光值A1，乳化液靜置30min后再次測定吸光度值A2，按下式計算乳化性和乳化穩定性[20]。

EAI/（m2/g）=（2×2.303×A1×D）/（Φ×c×L×10 000）

ESI/min=[（A1×Δt）/（A1-A2）]×100

式中：D為稀釋倍數；Φ為油相的體積分數，%；L為光程，1 cm；c為酸棗仁蛋白酶解產物質量濃度，g/mL；t為時間，min。

2.6 抗疲勞活性的測定

2.6.1 小鼠分組與給藥

小鼠在正常條件下自由攝食飲水，適應7 d后隨機分為5組（n=10）：空白對照組（等劑量蒸餾水）、酸棗仁蛋白組（SZP，200 mg/kg）、酸棗仁蛋白酶解產物低劑量組（SZPHs-LG，100 mg/kg）、酸棗仁蛋白酶解產物中劑量組（SZPHs-MG，200 mg/kg）以及酸棗仁蛋白酶解產物高劑量組（SZPHs-HG，400 mg/kg），連續給藥30 d。

2.6.2 小鼠負重游泳實驗

小鼠末次給藥30 min后，在其尾部固定其重量為其體重5%的鉛皮，置于水深30 cm的游泳箱中（50 cm×50 cm×40 cm）進行游泳實驗，水溫控制在（25±1）℃，記錄小鼠開始游泳至頭部沒入水面下10 s不能上浮所用的時間，游泳后將小鼠取出用吹風機吹干，休息5 d用于后續研究[21]。

2.6.3 抗疲勞生化指標的測定

末次給藥30 min后讓小鼠在無負重狀態下游泳90 min，休息1 h后摘眼球取全血，4℃放置3 h，凝固后3 000 r/min離心15 min制備血清；分離肝臟及骨骼肌組織，用生理鹽水制備成10%的組織勻漿，-80℃保存備用。測定全血中乳酸（blood lactic acid，BLA）含量、血清中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活力、血清尿素氮（serum urea nitrogen，SUN）含量；測定肝臟和骨骼肌中肝糖原、肌糖原、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、Na+-K+-三磷酸腺苷酶（Na+-K+-adenosine triphosphate protease，Na+-K+-ATPase）的含量，以上生化指標含量測定方法嚴格按照試劑盒說明操作[21]。

2.7 數據分析

采用SPSS 20.0軟件進行單因素（ANOVA）方差分析并進行兩兩比較，試驗結果均采用平均值±標準差表示，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 最佳蛋白酶的篩選

不同蛋白酶對酸棗仁蛋白酶解產物水解度和蛋白回收率的影響見圖1，對小鼠負重游泳時間的影響見表1。

圖1 不同蛋白酶對SZPHs水解度和蛋白回收率的影響Fig.1 Effect of different proteases on DH and rate of protein recovery of SZPHs

表1 不同SZPHs對小鼠負重游泳時間的影響Table 1 Effect of different SZPHs on forced swimming time in mice

如圖1和表1所示，3種蛋白酶均具有延長小鼠游泳時間的作用，同時具有較好的水解度和蛋白回收率，本研究從水解度、回收率、抗疲勞活性3個方面綜合考慮，選用堿性蛋白酶為最適蛋白酶。

3.2 酸棗仁蛋白酶解產物功能特性研究

3.2.1 溶解性

酸棗仁蛋白及其酶解產物溶解性如圖2所示。

由圖2可知，酶解產物溶解性明顯優于酸棗仁蛋白，并在較寬的pH值范圍（2～12）內具有良好的溶解性，這是由于蛋白質酶解處理后，水解成為分子量更小的肽段或者氨基酸，分子結構變小，比表面積增加，溶解性增強。酸棗仁蛋白及其酶解產物的溶解性在不同pH值條件下呈先下降后升高趨勢，并在pH 4時，酸棗仁蛋白及其酶解產物溶解性達到最小值，這是由于此時溶液pH值達到了酸棗仁蛋白的等電點，蛋白質的正負電荷數相等，分子間發生聚合，導致溶解性變小；當pH值小于或大于4時，蛋白質則以較多的正離子或負離子狀態存在，相同離子間相互排斥，靜電斥力增加，溶解性逐漸變大[22]。

圖2 不同pH值對SZP及SZPHs溶解性的影響Fig.2 Effect of different pH value on solubility of SZP and SZPHs

3.2.2 持水性、吸油性

持水性和吸油性試驗結果如圖3所示。

圖3 不同溫度對SZP及SZPHs持水性、吸油性的影響Fig.3 Effects at different temperature on water absorption and oil absorption capacity of SZP and SZPHs

由圖3可知，酸棗仁蛋白及其酶解產物的持水性受溫度影響不大，酸棗仁蛋白酶解產物的持水性遠遠小于酸棗仁蛋白，這是由于酸棗仁蛋白經酶解后，酶解產物的分子量變小，分子的界面面積變小，對水的吸附能力變小，進而導致其持水性變小。

酸棗仁蛋白及其酶解產物具有較好的吸油性。酸棗仁蛋白在較寬溫度范圍內吸油性變化不大，而酸棗仁蛋白酶解產物的吸油性隨著溫度的升高而降低，這是由于溫度升高時，油的黏度變小，其對酸棗仁蛋白酶解產物的吸附能力隨之減小，導致其吸油性變小[23]。

3.2.3 起泡性及起泡穩定性

起泡性和起泡穩定性試驗結果如圖4所示。

圖4 不同pH值對SZP及SZPHs起泡性及起泡穩定性的影響Fig.4 Effects at different pH value on foaming capacity and stability of SZP and SZPHs

如圖4所示，與酸棗仁蛋白相比，酸棗仁蛋白酶解產物具有良好的起泡性，這是因為酶解后溶解性顯著提升，溶于水后增強了蛋白的伸展性，提高了其起泡能力，同時酶解產物的黏度降低，有利于降低表面張力進而促進泡沫形成。此外，酸棗仁蛋白及其酶解產物在pH 2～12范圍內，起泡性變化規律為先減小后增大，并在pH 4時起泡性達到最低，此時為酸棗仁蛋白的等電點，溶解性較差，導致空氣-水界面的蛋白含量較低，起泡性較差，隨著pH值逐漸增大，溶解性逐漸增強，空氣-水界面分布的蛋白質逐漸增多，起泡性也隨著增強。

酸棗仁蛋白及其酶解產物起泡穩定性隨著pH值的增加呈現先增大后減小的趨勢。且酸棗仁蛋白酶解產物的起泡穩定性略低于酸棗仁蛋白，這是由于酸棗仁蛋白經酶解后所得酶解產物黏度降低，雖使得其起泡性增強，但同時也使得酶解產物與水形成的液膜強度降低，導致其起泡的穩定性低于酸棗仁蛋白。

3.2.4 乳化性及乳化穩定性

乳化性和乳化穩定性試驗結果如圖5所示。

由圖5可知，酸棗仁蛋白酶解產物的乳化性強于酸棗仁蛋白，這是由于蛋白質酶解后，蛋白分子中的疏水基團不斷暴露出來，有利于蛋白質吸附油水界面，促進其乳化性增強。乳化性變化規律與溶解性相似，且pH 4時乳化性達到最小，此時為酸棗仁蛋白的等電點，溶解性最小，油水界面上吸附的蛋白變少，形成乳狀液面的面積變小，導致此時乳化性降低，隨著pH值變大，蛋白質溶解性變大，分散在油水界面的蛋白質增多，有利于乳化性逐漸增強。

酸棗仁蛋白及其酶解產物乳化穩定性隨著pH值的增加呈先減小后增大再減小的趨勢。此外，酸棗仁蛋白酶解產物的乳化穩定性略強于酸棗仁蛋白，這是由于其溶解性大大提高，溶液體系中小分子蛋白含量增加，油水界面分布的蛋白增多，流動性增強，阻止了蛋白質的聚集，使得乳化穩定性有所提高。

圖5 不同pH值對SZP及SZPHs EAI和ESI的影響Fig.5 Effects at different pH value on EAI and ESI of SZP and SZPHs

3.3 抗疲勞活性研究

酸棗仁蛋白酶解產物對小鼠負重游泳時間、BLA、LDH、SUN的影響結果見表2。

表2 SZPHs對小鼠負重游泳時間、BLA、LDH、SUN的影響Table 2 Effects of SZPHs on forced swimming time，BLA and LDH activity，and SUN in mice

3.3.1 酸棗仁蛋白酶解產物對小鼠負重游泳時間的影響

如表2所示，連續給藥30 d后，與對照組相比，酸棗仁蛋白酶解產物各劑量組和酸棗仁蛋白組均可顯著延長小鼠負重游泳時間（P＜0.05），且酸棗仁蛋白酶解產物低劑量組延長效果與酸棗仁蛋白組相當，中、高劑量組延長效果強于酸棗仁蛋白組（P＜0.05），表明酸棗仁蛋白酶解產物可延長小鼠負重游泳時間，增強小鼠耐力，發揮抗疲勞的活性。

3.3.2 酸棗仁蛋白酶解產物對血清生化指標的影響

如表2所示，與對照組相比，酸棗仁蛋白酶解產物各劑量組和酸棗仁蛋白組可顯著降低BLA和SUN的含量（P＜0.05或 P＜0.01），提高 LDH 的活性（P＜0.05或P＜0.01）；此外酸棗仁蛋白酶解產物中BLA和SUN的減少率以及LDH活性均高于酸棗仁蛋白組（P＜0.05），表明酸棗仁蛋白酶解產物可催化乳酸轉化為丙酮酸，減緩乳酸積累，加速乳酸清除，同時降低血清中尿素氮的含量，起到抗疲勞的作用。

3.3.3 酸棗仁蛋白酶解產物組織生化指標的影響

酸棗仁蛋白酶解產物組織生化指標的影響結果見表3。

表3 SZPHs對肝肌糖原、SOD、GPX、MDA、Na+-K+-ATPase的影響Table 3 Effects of SZPHs on glycogen，SOD，GPX，MDA and Na+-K+-ATPase

與對照組相比，酸棗仁蛋白酶解產物各劑量組和酸棗仁蛋白組可顯著提升小鼠肝糖原、肌糖原儲備，提高體內Na+-K+-ATPase、SOD、GPX的活性，降低體內 MDA 的含量（P＜0.05或 P＜0.01）；與酸棗仁蛋白組相比，酸棗仁蛋白酶解產物中、高劑量組可顯著提升肝糖原、肌糖原含量（P＜0.05）；酸棗仁蛋白酶解產物各劑量組對SOD、GPX、Na+-K+-ATPase的活性影響和MDA的減少率也強于酸棗仁蛋白組（P＜0.05），表明酸棗仁蛋白酶解產物可提高小鼠體內糖原儲備、抑制體內氧化應激、提高能量代謝酶的活性，發揮抗疲勞的作用。

4 討論與結論

本研究對酸棗仁蛋白進行酶解處理，對酶解產物的功能特性進行了研究，并與酸棗仁蛋白進行了比較。結果表明，酸棗仁蛋白經酶解后，雖持水性和起泡穩定性有所降低，但其溶解性、吸油性、起泡性、乳化性及乳化穩定性均具有較大的提高，并在較寬的pH值和溫度范圍內保持良好的特性；特別是溶解性試驗中，酸棗仁蛋白酶解產物在水中具有快速全部溶解的特性，此特性優于其它植物蛋白酶解產物（如花生蛋白酶解物[24]、大豆蛋白酶解物[22]、核桃蛋白酶解物[7]等），當其被人體攝入后可有效溶解，提高其體內的吸收利用率，這表明酸棗仁蛋白酶解產物可作為一種添加劑有效應用到食品加工領域中。

本研究通過給小鼠灌胃酸棗仁蛋白及其酶解產物，測定酸棗仁蛋白酶解產物對小鼠負重游泳時間和相關抗疲勞的生化指標，研究其抗疲勞活性。實驗結果表明，酸棗仁蛋白酶解產物可有效延長小鼠負重游泳時間，提高體內LDH、SOD、GPX和Na+-K+-ATPase的活性以及肝糖原和肌糖原水平，并有效延緩BLA、SUN以及MDA的積累，提示酸棗仁蛋白酶解產物具有一定的抗疲勞活性。通過與酸棗仁蛋白相比較，發現酸棗仁蛋白酶解產物的抗疲勞活性略有提升，表明肽類物質的分子量小于蛋白的分子量，可更加有效地被人體吸收，提升其生物活性。此外，相關文獻報道[25]，不同分子量的酶解產物的抗疲勞活性也不相同，這其中分子量小于1 000 kDa的寡肽抗疲勞活性較為明顯，提示著生物活性與分子量大小有關，因此酸棗仁蛋白酶解產物的分離純化以及不同組分的活性也有待進一步研究。

綜上所述，酸棗仁蛋白酶解產物具有比酸棗仁蛋白更好的功能特性和抗疲勞活性，表明酸棗仁蛋白酶解產物可添加到食品中作為一種有效的氨基酸來源，發揮其營養價值和保健功效，為日后酸棗仁在保健食品領域的應用發展提供理論依據。