高效液相色譜法測定烯丙孕素的有關物質*

包汝潑，翁士喬，李開剛

（寧波三生生物科技有限公司，浙江 寧波 315000）

烯丙孕素為三烯21碳甾體類孕激素，屬19-睪丸酮系列［1］，是一種口服給藥，且有孕激素活性的化合物，和所有甾體類化合物一樣，具有脂溶性，能進入靶細胞，結合胞內特異性受體［2］，以類似于天然孕酮的作用來抑制促性腺激素的釋放。烯丙孕素是后備母豬同期發情的理想藥品［3］，可用于大規模批次化的人工授精［4］。另外，烯丙孕素可顯著改善乏情后備母豬繁殖性能，提高其發情率和產仔數，且對后代仔豬的生產性能無影響［5-8］。烯丙孕素的研究與應用已有近40年的歷史，目前國內外研究該產品的廠家較多，但未見其有關物質測定方法的公開報道。本研究中建立了一種簡單易行、專屬性強、靈敏度高的烯丙孕素有關物質檢測的高效液相色譜（HPLC）法，有助于烯丙孕素的質量控制研究［9-10］。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀［美國安捷倫科技公司，包含二極管陣列檢測器（DAD）］；XS205型分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

烯丙孕素原料藥（批號分別為151019，151028），烯丙孕素對照品（批號為151008，純度為99.4%），雜質A（批號為150701，純度為99.4%），雜質B（批號為150701，純度為99.7%），雜質C（批號為150701，純度為99.8%），結構見圖1，均由寧波三生生物科技有限公司合成室制備。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析級，水為超純水。

圖1 烯丙孕素及雜質化學結構式Fig.1 Chem ical structural formula of altrenogest and its impurities

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：GRACEAlltimaC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（60∶40，V/V）；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：316 nm；進樣量：20μL。

2.2 溶液制備

供試品溶液：取烯丙孕素原料適量，置50mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋成質量濃度為0.5mg/mL的溶液，即得。

對照品溶液：精密量取供試品溶液1mL，置100mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

雜質對照品貯備液：分別取雜質A、雜質B、雜質C對照品約10mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋成質量濃度為0.1mg/mL的溶液，即得。

對照品貯備液：取烯丙孕素對照品約10mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋成質量濃度為0.1mg/mL的溶液，即得。

系統適用性溶液：取烯丙孕素原料10mg，精密稱定，置20mL容量瓶中，分別精密加入雜質A，B，C對照品貯備液1mL于容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學考察

系統適用性及專屬性試驗：取2.2項下供試品溶液、系統適用性溶液及空白溶劑（流動相），按擬訂色譜條件進樣。結果空白溶劑不干擾檢測，烯丙孕素理論板數大于5 000，烯丙孕素與各雜質分離度良好。色譜圖見圖2。

圖2 系統適用性及專屬性試驗高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram s of system suitability test and specifcity test

破壞性試驗［11-12］：1）未破壞，取樣品約10 mg，置20mL容量瓶中，用流動相定容，搖勻，備用；2）酸破壞，取樣品約10mg，置20mL容量瓶中，加1mol/L鹽酸溶液2mL，室溫下放置2 h，加堿液調節溶液至中性，用流動相定容，搖勻，備用；3）堿破壞，取樣品約10mg，置20mL容量瓶中，加1mol/L氫氧化鈉溶液2mL，室溫下放置2 h，加酸液調節溶液至中性，用流動相定容，搖勻，備用；4）氧破壞，取樣品約10mg，置20mL容量瓶中，加30%雙氧水5mL，室溫下放置2 h，冷卻，調節溶液至中性，用流動相定容，搖勻，備用；5）高溫破壞，取樣品約10mg，置20mL容量瓶中，加水適量，溶解，置100℃水浴中放置12 h，冷卻，用流動相定容，搖勻，備用；6）強光破壞，取樣品約10mg，置20mL容量瓶中，加水適量，溶解，于光照強度4 500 lx條件下放置10 d，用流動相定容，搖勻。按擬訂色譜條件進樣測定。結果表明，經熱、氧、高溫破壞后降解不明顯，經酸、光破壞后有降解雜質產生，但與主峰分離度良好。詳見圖3。

線性關系考察：分別取烯丙孕素、雜質A、雜質B、雜質C、烯丙孕素對照品適量，精密稱定，加流動相制成質量濃度為10μg/mL的混合貯備液，精密量取混合貯備液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0mL，置10 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，按擬訂色譜條件分別進樣20μL測定，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標、質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程，并計算各雜質的校正因子。結果見表1。

表1 烯丙孕素及雜質的線性關系考察結果和檢測限Tab.1 Linear relationship and detection lim it of altrenogest and its impurities

圖3 破壞性試驗高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram s of destructive tests

檢測限確定：取2.2項下各溶液，將其稀釋至一定濃度，以3倍信噪比（S/N=3）測定。烯丙孕素及各雜質的檢測限見表1。

精密度試驗：取同一批（批號為151008）對照品6份，精密稱定，用流動相溶解并稀釋成質量濃度為0.5mg/mL的溶液。采用不同人員（實驗員1，2）及設備（Agilent 1260-1型，Agilent 1260-2型）按擬訂色譜條件進樣測定，以各雜質的測定結果進行計算。結果實驗員1采用Agilent 1260-1型HPLC儀所得結果的RSD為0，實驗員2采用Agilent1260-2型HPLC儀所得結果的RSD為0.80%，表明方法精密度良好。

穩定性試驗：取烯丙孕素原料藥（批號為151028）適量，依法制備供試品溶液，置室溫。精密量取20μL，分別在0，8，24，30h時按擬訂色譜條件進樣測定。結果的RSD為0.20%（n=3），表明烯丙孕素供試品溶液在30h內穩定性良好。

加樣回收試驗：分別精密量取雜質A、雜質B、雜質C對照品貯備液各4，5，6mL，置100mL容量瓶中，加入供試品溶液中，制成含標準物質濃度80%，100%和120%的溶液各3份（共9份），分別進樣20μL，按擬訂色譜條件進樣測定，帶入線性方程計算回收率，計算時扣除供試品已有的雜質含量（3.37μg/mL）。結果見表2。

2.4 樣品有關物質測定

精密量取2.2項下供試品溶液及對照品溶液各20μL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖至保留時間的2倍。結果見表3。

3 討論

3.1 檢測波長選擇

分別稱取烯丙孕素及雜質A，B，C適量，加流動相溶解并稀釋成質量濃度為0.5 mg/mL的溶液，通過DAD檢測器進行全波長掃描，發現在316 nm波長處烯丙孕素與各雜質的響應最接近，且雜質A和雜質B的相對響應因子在0.9～1.1間，可不使用校正因子，易于簡化方法。并對“專屬性試驗”項下樣品進行檢測，于316 nm波長下相較其他波長可檢測出更多未知雜質，故選用316 nm作為有關物質檢測波長。

表2 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.2 Results of recovery tests（n=9）

表3 烯丙孕素有關物質檢測結果（%）Tab.3 Detection results of related substances of altrenogest（%）

3.2 色譜柱選擇

本試驗中篩選了不同規格和品牌的C18色譜柱：GRACE Alltima silica C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Diamonsil C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Waters XTerra RP18柱（250mm×4.6mm，5μm），Agelavensil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），GRACE Alltima C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Welch Materials XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），OMNIBOND ORCA C18柱（250mm×4.6mm，5μm）。由于雜質A和烯丙孕素在色譜柱上的色譜行為極接近，而雜質B、雜質C和烯丙孕素的色譜行為差異較大，故重點考察雜質A和烯丙孕素的分離度。經篩選，上述色譜柱雜質A分離度分別為無分離效果，1.36，無分離效果，1.01，1.20，1.73，無分離效果，1.63。故最終確定色譜柱為GRACE Alltima C18柱（250mm×4.6mm，5μm）。

3.3 流動相選擇

本試驗中通過流動相組成對比（甲醇和乙腈），發現使用甲醇時，烯丙孕素與各雜質無法有效被洗脫分離，采用乙腈能使各雜質完全分離。通過調整乙腈比例（50%，55%，60%，65%，70%）進行條件優化，結果60%乙腈的分離效果最好，故選擇水-乙腈（40∶60，V/V）為流動相。

3.4 耐用性考察

通過對流速、柱溫、流動相比例進行微調，考察本方法的耐用性，結果上述條件的調整不影響烯丙孕素的有關物質檢測結果，表明該法靈敏度高、分離度好、專屬性強、結果準確，適用于烯丙孕素有關物質的檢測。