抗癇顆粒質(zhì)量標準研究

衛(wèi)向鋒，張 艷，牛春玲，王衛(wèi)峰，王海峰

（1.陜西省西安中醫(yī)腦病醫(yī)院，陜西 西安 710032； 2.陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，陜西 西安 710031；3.武警陜西總隊醫(yī)院，陜西 西安 710054）

抗癇顆粒由石菖蒲、天麻、羌活、丹參等16味中藥材組方，具有健脾豁痰、熄風止痙之功效，主要用于治療癲癇、風痰癇（痰蒙心竅、氣逆風動證），在陜西省西安中醫(yī)腦病醫(yī)院多年臨床經(jīng)驗方的基礎(chǔ)上開發(fā)而成。本研究中采用薄層色譜（TLC）法定性鑒別處方中的天麻、羌活、丹參、陳皮和枳實，采用超高效液相色譜（UPLC）法測定天麻中天麻素和對羥基苯甲醇的含量，為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供客觀的定性定量評價方法。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

WatersAcquityH-CLASS型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；BS210S型電子分析天平（精度為0.1mg），BT25S型電子分析天平（精度為0.01mg），均購自北京賽多利斯天平有限公司；FOEA26810D型純水機（德國Millipore公司）；KH-300DE型數(shù)控超聲波清洗機（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率為150W，頻率為40 kHz）；HH-4A型四孔水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；WS70-1型紅外快速干燥箱（上海市吳淞五金廠）；101型電熱鼓風干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；HCTP11B10型托盤藥物天平（北京市宣武區(qū)天平廠）；WFH-201B型三用紫外分析儀（上海精科實業(yè)有限公司，含WFH-201B型紫外透射反射儀）。

1.2 試藥

天麻素對照品（批號為110807-201809，供含量測定用，含量為96.7%），對羥基苯甲醇對照品（批號為111970-201702，供含量測定用，含量為99.4%），丹酚酸B對照品（批號為111562-201716，供含量測定用，含量為94.1%），橙皮苷對照品（批號為110721-201818，供含量測定用，含量為95.3%），羌活對照藥材（批號為120935-201408），丹參對照藥材（批號為120923-201615），陳皮對照藥材（批號為120969-201510），枳實對照藥材（批號為120936-201606），均由中國食品藥品檢定研究院提供；液相用試劑（色譜純，德國Merck公司）；色譜用水為超純水；其他試劑均為分析純（天津富宇化學試劑廠）；抗癇顆粒（醫(yī)院制劑，批號分別為20181101，20181102，20181103）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別[1-12]

天麻：取樣品5 g，研成細粉，置錐形瓶中，加70%甲醇15mL，超聲處理30min，濾過，濾液作為供試品溶液。同法制備缺天麻的陰性對照品溶液。取天麻素對照品適量，加甲醇，制得質(zhì)量濃度為1mg/mL的對照品溶液。分別吸取上述3種溶液，點于同一硅膠G板上，點樣量為5μL，以乙酸乙酯-甲醇-水（9∶1∶0.1，V/V/V）為展開劑展開，顯色劑用10%磷鉬酸乙醇溶液，105℃加熱顯色。結(jié)果供試品溶液色譜中檢出天麻素，陰性對照無干擾，詳見圖1 A。

羌活：取樣品5 g，研成細粉，置錐形瓶中，加甲醇15mL，超聲處理20min，取上清液作為供試品溶液。再同法制備缺羌活的陰性對照品溶液。取羌活對照藥材1g，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。分別吸取上述3種溶液，點于同一硅膠G板上，點樣量為5μL，以三氯甲烷-甲醇-氨水（7∶2∶0.5，V/V/V）為展開劑展開，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中檢出羌活，陰性對照無干擾，詳見圖1 B。

丹參：取樣品5 g，研成細粉，置錐形瓶中，加75%甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干后加水20 mL溶解，調(diào)pH至1～2，再用乙酸乙酯提取2次，每次25mL，水浴蒸干，加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。再同法制備缺羌活的陰性對照品溶液。取丹參對照藥材1 g，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。取丹酚酸B對照品適量，加乙醇制得質(zhì)量濃度為1mg/mL的對照品溶液。分別吸取上述4種溶液，點于同一硅膠G板上，點樣量為5μL，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2∶3∶4∶0.5∶2，V/V/V/V/V）為展開劑展開，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液中檢出丹參和丹酚酸B，陰性對照無干擾，詳見圖1 C。

陳皮和枳實：取本品5 g，研成細粉，置錐形瓶中，加甲醇30mL，超聲處理20min，濾過，取濾液15mL，濃縮至1mL，作為供試品溶液。再按供試品溶液制備方法制備缺枳實和陳皮的陰性對照品溶液。取橙皮苷對照品適量，加甲醇制得質(zhì)量濃度為1mg/mL的對照品溶液。再取陳皮和枳實對照藥材各1 g，同法制成對照藥材溶液。分別吸取上述4種溶液，點于同一硅膠G板上，點樣量為5μL，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13，V/V/V）為展開劑展開約4 cm，取出晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20∶10∶1∶1，V/V/V/V）的上層溶液為展開劑展至10 cm，以三氯化鋁試液為顯色劑，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中檢出橙皮苷，陰性對照無干擾，詳見圖1D。

圖1 薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatogram s

2.2 含量測定[13-15]

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：BEH C18柱（50mm×2.1mm，1.7μm）；流動相：乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97，V/V）；流速：0.3mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：室溫；進樣量：天麻素對照品溶液2μL，對羥基苯甲醇對照品溶液1μL，供試品溶液及空白對照溶液各2μL。理論板數(shù)按天麻素峰計大于5000，UPLC圖譜中，天麻素色譜峰分離良好，陰性對照無干擾。詳見圖2。

2.2.2 溶液制備

取天麻素對照品適量，精密稱定，溶于100mL乙腈-水（3∶97，V/V）混合溶液（質(zhì)量濃度為0.042mg/mL），即得。取對羥基苯甲醇對照品適量，精密稱定，溶于250mL乙腈-水（3∶97，V/V）混合溶液（質(zhì)量濃度為0.0239mg/mL），即得對照品溶液。取抗癇顆粒5g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入稀乙醇25mL，超聲提取30min，放冷，用溶劑補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10mL，濃縮至干，加乙腈-水（3∶97，V/V）混合溶液，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。同法制備缺丹參的陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取上述天麻素對照品溶液（0.4，0.8，1.0，2.0，4.0，8.0μL）及對羥基苯甲醇對照品溶液（0.4，0.8，1.0，2.0，4.0，8.0μL），按擬訂色譜條件進樣測定，以進樣量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y天=8010660.31X天-11907.30（r=1）及Y羥=8542598.13X羥-3976.08（r=1）。結(jié)果表明，天麻素和對羥基苯甲醇進樣量分別在0.0168～0.3360μg和0.00478～0.09560μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：分別精密吸取天麻素對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.042mg/mL）及對羥基苯甲醇對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.0239mg/mL），按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6次。結(jié)果天麻素和對羥基苯甲醇峰面積的RSD分別為0.14%和0.24%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取新制備的同一供試品溶液，在室溫下測定10h內(nèi)的穩(wěn)定性（每隔2h測1次）。結(jié)果天麻素和對羥基苯甲醇峰面積的 RSD分別為0.83%和2.58%（n=6），表明供試品溶液在10h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一批（批號為20181101）樣品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定天麻素和對羥基苯甲醇含量。結(jié)果天麻素平均含量為0.9546mg/g，RSD為1.75%（n=6），對羥基苯甲醇平均含量為0.1853mg/g，RSD為1.50%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的抗癇顆粒樣品細粉6份，每份約0.5g，精密稱定，分別加入一定量的天麻素和對羥基苯甲醇對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果見表1。

圖2 超高效液相色譜圖Fig.2 UPLC chromatograms

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.1 Resultsofrecoverytests（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取3批樣品各適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果見表2。

表2 3批樣品中天麻素和對羥基苯甲醇的含量測定結(jié)果（mg/g）Tab.2 Results of content determ ination of gastrodin and p-hydroxybenzenylmethanol in 3 batches of sam ples（mg/g）

3 討論

3.1 薄層鑒別指標選擇及色譜條件優(yōu)化

處方中天麻、羌活、丹參、陳皮和枳實5味藥材為主藥，且藥效成分清楚，可建立穩(wěn)定可行的薄層色譜鑒別法，因此建立了5味藥材的質(zhì)量標準。考慮到抗癇顆粒提取工藝為水煎煮，因此鑒別指標主要選擇水溶性有效成分，其中天麻鑒別指標選擇其主要水溶性有效成分天麻素［16-18］；羌活鑒別指標選擇羌活對照藥材［19］；丹參鑒別指標選擇丹參對照藥材和水溶性有效成分丹酚酸B［20］；橙皮苷為陳皮和枳實中共有水溶性有效成分［21-23］，故選擇橙皮苷為兩者的鑒別指標。根據(jù)研究結(jié)果，所建立的5味藥材的薄層色譜鑒別法有較強專屬性，陰性對照均無干擾，可有效控制抗癇顆粒的質(zhì)量。

3.2 含量測定指標選擇及色譜條件優(yōu)化

天麻素是天麻中主要有效成分，具有抗癲癇作用［17-18］，主要作用機制為保護神經(jīng)、膠質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮損傷而發(fā)揮抗癲癇作用。通過對治療癲癇的中醫(yī)處方的考證發(fā)現(xiàn)，其核心藥物均有天麻［18］。本研究中以天麻素和天麻素苷元（對羥基苯甲醇）為含量測定指標，采用UPLC法測定，用以表征制劑質(zhì)量，檢測波長采用《中國藥典》中“天麻”項下所用波長，流動相采用乙腈-0.05%磷酸溶液，反復調(diào)整比例，以拖尾因子、分離度、理論板數(shù)、基線作為評判標準，最終確定色譜條件，即流動相為乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97，V/V），流速為0.3 mL/min。該方法精密度、重復性及回收率均良好，供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，可用于抗癇顆粒的質(zhì)量控制。