正交試驗優選鐵力木花蕾總黃酮提取工藝*

馬俊鵬，周美霞，李曉倩，王曉梅△，王新玲，胡君萍，依明·尕哈甫

（1.新疆維吾爾自治區人民醫院，新疆 烏魯木齊 830000； 2.新疆醫科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011）

鐵力木MesuaferreaL.為藤黃科鐵力木屬常綠喬木，主要分布于印度、斯里蘭卡及中國云南、廣東、廣西等地［1］。鐵力木的樹皮、葉子、花和果實均有藥用價值，在民間主要用于治療蛇毒咬傷、出血和腳部灼傷等［2］，具有抗炎、抗抑郁、抗腫瘤等多種藥理活性［3-6］。鐵力木花蕾作為新疆常用藥材收錄于《中華本草》等醫藥著作［7］，具有抗腫瘤、抗菌、抑制血小板聚集等作用［8-10］，主要化學成分有香豆素類、黃酮類、三萜類、莽草酸類等［11-14］。鐵力木花蕾，且含有較豐富的黃酮類成分，不同極性部位的黃酮含量不同［15］。本研究中在單因素試驗基礎上采用正交試驗優化了鐵力木花蕾總黃酮的提取工藝?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

T6型紫外可見分光光度儀（北京普析通用儀器有限責任公司）；AB104-N型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司）；EYELA N-1001型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）；KQ-700DV型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S4型數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠）。

1.2 試藥

蘆丁對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號為B20771，純度＞98%）；其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

鐵力木花蕾購自新疆維吾爾自治區維吾爾醫醫院藥劑科，由新疆醫科大學藥學院王曉梅副教授鑒定為正品。將藥材粉碎，過40目篩，備用。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 溶液制備

對照品溶液：取蘆丁對照品10 mg，精密稱定，置25mL容量瓶中，以60%乙醇超聲（功率100W，頻率40 kHz）處理，并定容，即得質量濃度為0.4mg/mL的蘆丁對照品溶液。

供試品溶液：取鐵力木干燥花蕾粉末1 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，加60%乙醇30mL，回流提取2.0 h，提取3次。合并3次提取液，以60%乙醇定容至25mL，即得。

2.1.2 方法學考察

檢測波長選擇：取對照品溶液，在200～600 nm波長范圍內掃描。結果蘆丁在510 nm波長處有最大吸收，故選擇510 nm作為測定波長。

線性關系考察：分別精密量取2.1.1溶液制備項下對照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL，置10mL容量瓶中，加60%乙醇定容，搖勻，制成系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液適量，在選定波長處進樣測定，記錄吸光度（A），以蘆丁質量濃度（C，μg/mL）為橫坐標、A為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程A=15.38C-0.028，r=0.999 0（n=5）。結果表明，蘆丁質量濃度在0.01～0.08mg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。

精密度試驗：取上述對照品溶液適量，在選定波長處測定6次，記錄吸光度。結果蘆丁吸光度的RSD為0.51%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，10，12 h時在選定波長處測定，記錄吸光度。結果總黃酮吸光度的RSD為2.55%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置12 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品適量，精密稱定，按2.1.1溶液制備項下方法制備供試品溶液，在選定波長處測定6次，記錄吸光度并計算含量。結果總黃酮含量平均值的RSD為1.96%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量樣品適量，共9份，分別加入低、中、高質量濃度的對照品溶液，依法制備供試品溶液，在選定波長處測定，記錄吸光度并計算回收率。結果見表1。

表1 蘆丁加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Resu lts of recovery tests（n=9）

2.2 含量測定和出膏率測定

取樣品適量，分別依法制備供試品溶液，在選定波長處測定，平行測定3次，記錄吸光度并計算樣品含量。精密吸取供試品溶液適量，置蒸發皿中，蒸干，冷卻后稱定質量，計算出膏率。出膏率（%）=［（蒸發皿質量+浸膏質量）-蒸發皿質量］/藥材質量×100%。

2.3 總黃酮測定方法權衡

采用綜合評分法，設定藥材中總黃酮含量的權重為0.7，出膏率的權重為0.3。綜合評分（Y）=總黃酮含量×0.7+出膏率×0.3。

2.4 單因素試驗

提取方法：取樣品1 g，精密稱定，分別以超聲法、回流提取法提取總黃酮。結果超聲法、回流提取法綜合評分分別為45.72分，59.90分，故選擇回流提取法。

提取溶劑：取樣品1g，精密稱定，置50mL圓底燒瓶中，分別加水及20%，40%，60%，80%，100%乙醇25mL，回流提取2.0 h。結果以60%乙醇提取時，總黃酮綜合評分最高，故選擇60%乙醇作提取溶劑。詳見圖1。

圖1 提取溶劑篩選Fig.1 Selection of extraction solvent

提取時間：取樣品1 g，精密稱定，置50mL圓底燒瓶中，加60% 乙醇25 mL，分別回流提取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h。結果，回流提取2.0時，總黃酮綜合評分最高，故選擇提取2.0 h。詳見圖2。

圖2 提取時間篩選Fig.2 Selection of extraction time

溶劑量：取樣品1g，精密稱定，置50mL圓底燒瓶中，分別加60%乙醇10，15，20，25mL，回流提取2.0 h。結果以25mL乙醇進行回流提取時，總黃酮綜合評分最高，故選擇溶劑量為25mL。詳見圖3。

圖3 溶劑量篩選Fig.3 Selection of solvent amount

2.5 正交試驗

根據單因素試驗結果，以提取時間（A）、提取次數（B）、溶劑量（C）為考察因素，以浸膏得率為考察指標，采用L9（34）正交試驗設計優選鐵力木花蕾總黃酮提取工藝。因素與水平見表2，試驗設計與結果見表3，方差分析結果見4。由表3、表4可知，鐵力木花蕾總黃酮提取效率的影響大小依次為提取次數（B）＞溶劑量（C）＞提取時間（A），其中提取次數為主要影響因素，其次為溶劑量。故確定最優提取工藝為A1B3C3。

表2 L9（34）正交試驗因素與水平表Tab.2 Factors and their levels

2.6 驗證試驗

取樣品5.0 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，取適量，在選定波長處測定吸光度，并計算含量。結果樣品中總黃酮的平均含量為221.97 mg/g，綜合評分為155.49分，表明該提取工藝合理，結果見表5。

3 討論

本研究中，采用單因素試驗考察了鐵力木花蕾總黃酮的提取方法、提取溶劑、提取時間、提取次數、溶劑量等因素，在此基礎上，采用L9（34）正交試驗設計優選鐵力木花蕾總黃酮的提取工藝。結果顯示，鐵力木花蕾總黃酮提取效率的主要影響因素為提取次數，其次是提取溶劑量。按此最佳提取工藝得到的鐵力木花蕾60%乙醇提取物中總黃酮含量較高，達221.97mg/g。表明該方法提取效率較高，同時操作簡便，成本較低，可為鐵力木花蕾的進一步開發利用提供可靠依據。

表3 L9（34）正交試驗設計與結果（n=9）Tab.3 Design and results of L9（34）orthogonal test（n=9）

表4 方差分析結果Tab.4 Results of ANOVA

表5 驗證試驗結果Tab.5 Resu lts of verification test