基于網絡藥理學的葡萄籽油抗癌和抗腫瘤功能成分及機制研究

張麗明，馬雅鴿，張 希，趙聲蘭?，陳朝銀，梁仲雄

（1. 云南中醫藥大學，云南 昆明 650500；2. 云南經濟管理學院，云南 昆明650106；3. 云南成滿生物科技有限公司，云南 大理 671600）

癌癥是嚴重危害人類身體健康的常見疾病。據全球腫瘤流行病統計數據GLOBOCAN 2018估計，世界癌癥新發病例約有 1 808萬例，而死亡病例約 956萬例，其中中國分別約占 23.7%和30%。在地域發病情況方面，亞洲的癌癥死亡數占全球 57.3%，且預后差、死亡率高的癌癥類型在這些地區發生率較高[1]。癌癥的發病形勢日益嚴峻，使得腫瘤預防和治療的社會壓力和醫療壓力與日俱增。現代醫學對癌癥的治療主要以手術、化療、放療及靶向藥物為主，由于其較大的副作用及腫瘤自身的消耗性，患者正氣虛弱、氣血虧損，治療效果不盡人意，甚至出現“一邊治療，一邊轉移”的現象[2]。近幾年來，中藥由于其藥源廣泛，副作用小等特點備受關注，成為抗腫瘤藥物研究的熱點[3]。

葡萄籽是葡萄科葡萄屬植物葡萄（Vitis viniferaL.）的種子。葡萄籽油是葡萄籽活性部位之一，含有豐富的亞油酸[4]、維生素E[5-6]、植物甾醇[7-8]、多酚[9-10]、角鯊烯[11]和類胡蘿卜素[12]等活性成分，具有延緩衰老、抑制肥胖、抗癌、抗腫瘤、抗炎、降血脂等生物功能[13]。網絡藥理學主要通過文獻挖掘等方法構建生物信息網絡，通過分析網絡拓撲結構以及選取特定信號節點進行藥物作用多靶點預測，其研究思路與中醫藥整體觀念相一致，可應用于解決中藥及復方研究中多成分、多靶點、協同作用特點帶來的難題[14]。本研究基于網絡藥理學的方法挖掘葡萄籽油抗癌和抗腫瘤的活性成分及作用靶點，揭示其作用機制。

1 材料與方法

1.1 葡萄籽油活性成分及靶點的收集

通過查閱文獻收集葡萄籽油的活性成分及利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）獲得其口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、類藥性（drug-likeness，DL）和小腸上皮細胞滲透率（Caco-2 permeability）值及各活性成分對應靶點，匯集靶點，并通過Uniprot數據庫（https://www.uniprot.org/）將藥物靶點的蛋白名稱轉換成GeneCards數據庫（https://www.genecards.org/）的基因名稱。

1.2 癌癥/腫瘤相關靶點的搜集

從在線孟德爾人類遺傳數據庫（OMIM，https://www.omim.org/）和人類基因數據庫（Gene-Cards，https://www.genecards.org/）中收集與關鍵詞“cancer”和“tumor”相關的靶點，整理獲得癌癥和腫瘤相關靶點。

1.3 活性成分-疾病靶點網絡構建及可視化分析

使用Venn在線軟件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）將活性成分靶點-癌癥和腫瘤相關靶點取交集，獲得葡萄籽油的潛在抗癌和抗腫瘤靶點。將交集靶點導入 Cytoscape3.7.2軟件[15]，建立藥物-活性成分-靶點-疾病網絡圖。圖中節點（node）代表葡萄籽油、活性成分、靶點、疾病，邊（edge）分別代表活性成分和靶點或靶點和疾病的交互作用。

1.4 蛋白互作網絡（PPI網絡）的構建

將篩選得到的潛在抗癌和抗腫瘤靶點導入String[16]（https://string-db.org， ver 11.0）在線平臺數據庫，以研究靶蛋白相互作用，設置物種為“人類”，構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡（PPI網絡）。在PPI圖中，每一個實心圓圈代表一個基因，圓圈的中間顯示蛋白質的結構，而圓圈由不同顏色的線條連接。每一線條代表蛋白質與蛋白質之間的生物學過程，包括基因表達調控、信號轉導、細胞遷移等。

1.5 GO 功能和KEGG通路富集分析

采用DAVID6.8數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），對葡萄籽油潛在抗癌和抗腫瘤靶點進行GO功能分析，以了解靶點的生物學過程，KEGG通路分析研究藥物靶點主要信號通路，DAVID平臺列表與背景均設置為“Homo sapiens”（人類），GO富集分析選擇生物過程（biological process）、分子功能（molecular function）和細胞組成（cellular component）3個模塊，通路分析選擇KEGG。

2 結果

2.1 葡萄籽油活性成分及靶點的篩選

通過已有文獻報道[17-20]，篩選得到葡萄籽油主要活性成分15種，為脂肪酸及其油脂伴隨物。利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）檢索到葡萄籽油主要活性成分除角鯊烯外均有對應靶點，總計 366個，刪除重復項，共獲得 236個活性成分靶點。葡萄籽油主要活性成分信息見表1。

2.2 葡萄籽油活性成分抗癌和抗腫瘤靶點收集

在兩個疾病數據庫中輸入關鍵詞“cancer”和“tumor”進行疾病靶點搜索，GeneCards數據庫以 score≥30進行篩選，得到 667個，OMIM數據庫得到24個，合并獲得686個癌癥和腫瘤相關靶點。利用Venn在線軟件將葡萄籽油活性成分對應的209個藥物靶點（刪除未找到基因名稱的靶點）與癌癥及腫瘤相關的686個疾病靶點取交集，通過Venn圖（如圖1）的形式得到93個葡萄籽油潛在抗癌和抗腫瘤靶點（見表2）。

圖1 藥物靶點與疾病靶點關系圖Fig.1 The relationship between drug targets and disease targets

表2 葡萄籽油潛在抗癌和抗腫瘤靶點信息Table 2 Information on potential anti-cancer and anti-tumor targets of grape seed oil

續表2

2.3 葡萄籽油活性成分-抗癌和抗腫瘤靶點網絡構建

利用 Cytoscape 3.7.2軟件建立藥物-活性成分-靶點-疾病的可視化網絡圖（圖 2），共有108個節點、390條邊，其中紅色節點代表葡萄籽油，13個紫色節點代表葡萄籽油的活性成分，93個藍色節點代表癌癥和腫瘤靶點，黃色節點代表癌癥和腫瘤，390條邊代表節點之間的相互作用。該網絡中化合物的平均度值為22.77，由高到低依次為 Trans-resveratrol（反式白藜蘆醇）（degree=158）、ursolic acid（熊果酸）（degree=68）、(-)-epicatechin（表兒茶素）（degree=24）、palmitic acid（棕櫚酸）（degree=14）、(+)-catechin（兒茶素）（degree=6）、Stigmasterol（豆甾醇）（degree=6）、Vitamin E（維生素 E）（degree=4）、stearic acid（硬脂酸）（degree=4）、oleic acid（油酸）（degree=4）、brassicasterol（菜籽甾醇）（degree=2）、Erucic acid（芥酸）（degree=2）、Linolenic acid（亞麻酸）（degree=2）、Linoleic acid（亞油酸）（degree=2），其中反式白藜蘆醇、熊果酸、表兒茶素、棕櫚酸等可能是主要抗癌和抗腫瘤物質基礎。由圖可知，Trans-resveratrol（反式白藜蘆醇）作用于PTGS2、BCL2、IL10、TNF、PTEN、PLAU、CAT、AKT1、JUN、IL6、CASP3、CCL2、IL1A、RELA 等 79個靶點，ursolic acid（熊果酸）作用于PTGS2、BCL2、TNF、PLAU、JUN、IL6、CASP3、CREB1、RELA、STAT3等34個靶點，(-)-epicatechin（表兒茶素）作用于 PTGS2、TNF、PLAU、ESR1、AKT1、JUN、IL6、CASP3、CREB1、CCL2、IL2、IL1A這12個靶點，palmitic acid（棕櫚酸）作用于 PTGS2、CTSD、BCL2、IL10、TNF、COL1A1、PTEN這7個靶點；靶點PTGS2與Linoleic acid（亞油酸）、oleic acid（油酸）、palmitic acid（棕櫚酸）、stearic acid（硬脂酸）、Linolenic acid（亞麻酸）、Erucic acid（芥酸）、Stigmasterol（豆甾醇）、Vitamin E（維生素E）、(+)-catechin（兒茶素）、(-)-epicatechin（表兒茶素）、Trans-resveratrol（反式白藜蘆醇）、ursolic acid（熊果酸）這 12個化合物相互作用，TNF、PLAU等多個靶點均與(-)-epicatechin（表兒茶素）、Trans-resveratrol（反式白藜蘆醇）、ursolic acid（熊果酸）作用，體現了葡萄籽油多成分、多靶點協同抗癌和抗腫瘤的作用。

圖2 葡萄籽油活性成分-抗癌和抗腫瘤靶點網絡Fig.2 Active ingredients of grape seed oil-anti-cancer and anti-tumor target network

2.4 蛋白質相互作用網絡構建

應用String在線平臺對葡萄籽油的93個潛在抗癌和抗腫瘤靶點進行PPI蛋白互作網絡分析，設置物種為“人類”，將蛋白相互作用評分置信度設置為0.900，隱藏離散的靶點，獲得PPI網絡圖（如圖3）。該網絡中包含93個節點，482條邊，平均節點度為 10.4。根據節點度值大小，關鍵靶點依次有信號轉導子和轉錄激活子 3（STAT3）、絲裂原激活的蛋白激酶1（MAPK1）、絲裂原激活的蛋白激酶 3（MAPK3）、腫瘤抑制蛋白 p53（TP53）、轉錄因子AP-1（JUN）、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、轉錄因子p65（RELA）、腫瘤壞死因子（TNF）、絲裂原激活的蛋白激酶8（MAPK8）、原癌基因 c-Fos（FOS）、白介素 6（IL6）、血管內皮生長因子 A（VEGFA）、Myc原癌基因蛋白（MYC）、雌激素受體（ESR1）、半胱天冬酶 8（CASP8）、半胱天冬酶 3（CASP3）等，這些靶蛋白在PPI網絡中具有重要地位，與其他多個靶點相連，可能與葡萄籽油發揮抗癌和抗腫瘤作用關系密切。

圖3 葡萄籽油潛在抗癌和抗腫瘤靶點的PPI網絡Fig.3 PPI network of potential anti-cancer and anti-tumor targets of grape seed oil

2.5 GO 功能富集分析

將葡萄籽油 93個潛在抗癌和抗腫瘤靶點進行GO富集分析（見圖4），獲得607條生物學過程條目，其中P＜ 0.05的生物學過程有477條，富集的前20個生物學功能依次為蛋白質結合（84個靶點）、相同的蛋白質結合（28個靶點）、酶結合（23個靶點）、蛋白質異二聚活性和蛋白質均二聚活性及轉錄因子結合（19個靶點）、蛋白激酶結合（15個靶點）、轉錄調控區DNA結合（14個靶點）、序列特異性DNA結合（14個靶點）、細胞因子活性（12個靶點）、RNA聚合酶II核心啟動子近端區域序列特異性DNA結合（11個靶點）、轉錄激活子活性及RNA聚合酶II核心啟動子近端區域序列特異性結合（10個靶點）、生長因子活性和蛋白質復合物結合及激酶活性（9個靶點）、蛋白酶結合（8個靶點）、半胱氨酸型內肽酶活性（6個靶點）、蛋白磷酸酶2A結合和腫瘤壞死因子受體結合（5個靶點）、BH3域結合（4個靶點），表明葡萄籽油可通過參與調控多種生物學過程而發揮抗癌和抗腫瘤作用。

2.6 KEGG 信號通路分析

對葡萄籽油 93個潛在抗癌和抗腫瘤靶點進行KEGG通路注釋分析，獲得119條信號通路條目，其中P＜ 0.05的通路有113條，包括大腸癌、胰腺癌、前列腺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、神經膠質瘤、腎細胞癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌等通路，涉及 NOD樣受體信號通路、MAPK信號通路、p53信號通路、ErbB信號通路、mTOR信號通路、VEGF信號通路、Wnt信號通路等經典信號通路，排名靠前的條目有癌癥通路、TNF信號通路、FoxO信號通路、細胞凋亡、癌癥中的蛋白聚糖通路、PI3K-Akt信號通路、癌癥中的MicroRNA通路、癌癥中的轉錄失調通路、非酒精性脂肪肝病（NAFLD）、神經營養蛋白信號通路、炎性腸病（IBD）、Toll樣受體信號通路、慢性粒細胞白血病、甲狀腺激素信號通路、HIF-1信號通路等。由此推測，葡萄籽油可能通過調節以上信號通路來發揮抗癌和抗腫瘤作用，富集的前 20條通路分析結果見表 3。

圖4 葡萄籽油潛在抗癌和抗腫瘤靶點GO富集結果柱形圖Fig.4 Bar graph of GO enrichment results of potential anti-cancer and anti-tumor targets of grape seed oil

3 討論

葡萄籽油是一種性能良好、營養價值極高、對人體無毒無害無副作用且完全符合食品衛生標準的功能型食用油脂，因其豐富的不飽和脂肪酸組成、無煙特性且加熱不易產生有害物質等特點而成為近年來備受歡迎的高端食用油[13]。目前關于葡萄籽油抗癌研究較少，有研究結果顯示，葡萄籽油對HT-29結腸癌細胞增殖有顯著的抑制作用[21]。另有報道，葡萄籽油已被嘗試作為納米制劑的載體用于癌癥的治療[22]。根據文獻報道[13，18]，葡萄籽油含有亞油酸、多酚類物質、維生素 E、植物甾醇、角鯊烯等成分，這些成分均有抗癌和抗腫瘤的生物學功能，可見葡萄籽油在治療癌癥和腫瘤方面潛力極大。本研究結果顯示，反式白藜蘆醇、熊果酸、表兒茶素、棕櫚酸等化合物在葡萄籽油活性成分-抗癌和抗腫瘤靶點網絡中與其他多個疾病靶點相連，可能是主要抗癌和抗腫瘤物質基礎。反式白藜蘆醇、表兒茶素均為多酚類物質，此外，豆甾醇、維生素 E、菜籽甾醇、亞油酸雖不是關鍵靶點，但與疾病靶點也有一定關聯，說明本研究結果與文獻報道相吻合。另外，角鯊烯也具有抗腫瘤作用[13]及有效預防和抑制化學誘導的結腸癌、胰腺癌、皮膚癌等多種癌癥的發生[18]，可能是由于其在植物油脂中存在量較少、研究較少，所以未能在數據庫中找到其作用靶點。

PPI網絡分析發現，葡萄籽油抗癌和抗腫瘤的關鍵靶點依次為 STAT3、MAPK1、MAPK3、TP53、JUN、AKT1、RELA、TNF、MAPK8、FOS、IL6、VEGFA、MYC、ESR1、CASP8、CASP3等，這些關鍵靶點參與調控酶結合、蛋白質結合、轉錄因子結合、蛋白質異二聚活性、轉錄調控區DNA結合、細胞因子活性、蛋白激酶結合、蛋白質均二聚活性、BH3域結合、蛋白酶結合、生長因子活性、序列特異性 DNA結合、轉錄激活子活性及RNA聚合酶II核心啟動子近端區域序列特異性結合、蛋白磷酸酶 2A結合、蛋白質復合物結合、腫瘤壞死因子受體結合、半胱氨酸型內肽酶活性、RNA聚合酶II核心啟動子近端區域序列特異性 DNA結合、激酶活性等生物學功能，參與大腸癌、胰腺癌、前列腺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、神經膠質瘤、腎細胞癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌等通路的調控，NOD樣受體信號通路、MAPK信號通路、p53信號通路、ErbB信號通路、mTOR信號通路、VEGF信號通路、Wnt信號通路等經典信號通路的調控。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學的方法，預測了葡萄籽油抗癌和抗腫瘤作用的功能成分及作用靶點、生物學過程與富集通路，從分子的角度探討其抗癌和抗腫瘤作用機制，體現了葡萄籽油通過多成分、多靶點、多途徑的方式來治療癌癥和腫瘤。