黑小麥麩皮抗氧化活性成分提取及其抗氧化能力評價

于章龍 ，劉 瑞 ，宋 昱 ?，謝颯英 ，蔡 岳 ，孫元琳，郭園園，劉峰娟

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 棉花研究所，山西 運(yùn)城 044000；2. 運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000；3. 河津市通河食品有限公司，山西 運(yùn)城 044000）

麩皮是谷物加工的副產(chǎn)物，主要由皮層和糊粉層所組成。在實(shí)際制粉工藝中，提取胚和胚乳后的殘留物統(tǒng)歸為麩皮，約占籽粒重量的22%～25%左右[1]。麩皮中的維生素、礦物質(zhì)等較胚乳含量豐富，且富含多種生理活性物質(zhì)，其中酚類物質(zhì)研究是熱點(diǎn)之一[2-3]。麩皮中主要酚類物質(zhì)包括酚酸、黃酮、木酚素等。酚酸主要為阿魏酸，約占麩皮的 0.4%～0.7%，黃酮約占麩皮的0.2%[4-6]。大量研究證明，谷物中的酚類化合物作為重要的膳食抗氧化組分，對預(yù)防人類機(jī)體氧化應(yīng)激和心血管疾病具有突出的防護(hù)作用[7-8]。全谷物攝入對慢性疾病的預(yù)防作用主要?dú)w功于膳食纖維及其與之共價鍵連接的酚酸類物質(zhì)，被稱為“膳食纖維-酚類抗氧化劑復(fù)合物”[9]。而此類活性物質(zhì)主要存在于谷物麩皮中。黑小麥?zhǔn)侵阜N子的顏色較深，呈藍(lán)、紫、紫黑、黑等顏色小麥的統(tǒng)稱，是目前研究機(jī)構(gòu)采取不同的育種手段而培育出來的特型優(yōu)質(zhì)小麥。黑小麥麩皮中不僅富含酚酸、黃酮且富含花青素[10-11]。本研究以黑小麥麩皮為原料提取抗氧化活性成分并對其抗氧化活性進(jìn)行評價，為黑小麥副產(chǎn)物的深加工及利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

運(yùn)黑14207麩皮：山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所制取；1，1-二苯代苦味酰基自由基、2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸二銨鹽、福林試劑、沒食子酸，均為分析純：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 主要儀器設(shè)備

UV-9000S 可見-紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限責(zé)任公司；2XZ-4B型真空冷凍干燥機(jī)：浙江臨海市永昊真空設(shè)備有限公司；KS-100AL超聲清洗機(jī)：深圳市潔康洗凈電器有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；JMFB70*30實(shí)驗(yàn)室小麥磨粉機(jī)：中儲糧公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 運(yùn)黑14207麩皮制備

按照GB/T20571—2006標(biāo)準(zhǔn)磨粉，并獲得試驗(yàn)材料麩皮。然后，將麩皮于-18 ℃下放置24 h，再經(jīng)真空冷凍干燥24 h后放入自封袋冷藏備用。

1.3.2 溶劑配制及萃取方法

分別配制50%、75%、100%甲醇、乙醇、丙酮溶液，以蒸餾水為對照。

準(zhǔn)確稱取麥麩20 g，按照料液比1∶10分別與上述溶液混合，40 kHz功率超聲輔助提取30 min，然后進(jìn)行抽濾，在0.09 Mpa、65 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)獲得提取液，再將提取液倒入平面玻璃器皿中，放置12 h后放入冰箱冷凍24 h，最后進(jìn)行冷凍干燥，稱重并計(jì)算得率。凍干樣品真空包裝冷藏備用。

1.3.3 提取物總酚含量測定

參照 Folin-Ciocalteu試劑法并稍作修改[12]。以沒食子酸（GAE）為標(biāo)準(zhǔn)品，總酚含量以每100 mg提取物（干基）中所含相當(dāng)于沒食子酸的質(zhì)量表示樣品中總酚含量（Total phenolic， TP）。

準(zhǔn)確移取100 μL標(biāo)準(zhǔn)液、500 μL斐林試劑液和 6 mL蒸餾水于小試管中，1 400 r/min震蕩1 min，對照樣為純水。

加入2 mL15%Na2CO3溶液，繼續(xù)1 400 r/min震蕩0.5 min。然后用蒸餾水定容至10 mL。避光靜止2 h，然后在750 nm處測量吸光值。

總酚提取能力（Total phenolic extraction capacity， TPEC）=EY×TP×100。定義為溶液提取總酚能力。

1.3.4 提取物對DPPH自由基清除力測定

測定方法參照文獻(xiàn)[13-14]并稍作修改，清除力以半數(shù)抑制率IC50值計(jì)。

稱取樣品干物質(zhì) 0.2 g于錐形瓶，用 50 mL 75%乙醇溶解，密封超聲波輔助溶解，制備樣品濃度為4 mg/mL溶液。稱取0.2 g DPPH溶解于50 mL 75%乙醇，稀釋至濃度為0.04 mg/mL，避光保存。

將上述溶液各取5 mL等比例混合，避光靜置30 min后于517 nm處測定吸光值。樣品對DPPH清除率I%按照下式計(jì)算：

A-樣品和DPPH混合液的吸光度值

A1-陽性空白（無DPPH溶液）吸光度值

A0-陰性空白（無樣品溶液）的吸光度值

將上述濃度為4 mg/mL樣品溶液分別配制成濃度為0.3、0.6、1.2、1.8、2.4、4 mg/mL的樣品液，然后與 DPPH溶液等比例混合，避光靜置30 min后測吸光度值。

抗氧化物提取能力（Antioxidants extraction capacity determined by DPPH， AEC）按照下式計(jì)算。

1.3.5 提取物對ABTS自由基清除力測定

測定方法參照文獻(xiàn)[15-16]并稍作修改，清除力以半數(shù)抑制率IC50值計(jì)。

稱取樣品干物質(zhì)0.2 g于錐形瓶中，用50 mL的蒸餾水溶解，超聲波輔助溶解，溶液澄清透明時停止，將樣品液稀釋為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL。

取1 mL樣品溶液與1.5 mL ABTS自由基溶液混合，靜置6 min，于420 nm處測定吸光值。清除率、IC50(ABTS)和AECABTS計(jì)算方法同1.3.4。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用origin 75作圖，利用SPSS V13.0軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果采用方差分析（ANOVA）和鄧肯檢驗(yàn)，半數(shù)抑制率IC50采用SPSS V13.0進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑麩皮提取物得率

麩皮中含有主要營養(yǎng)成分為膳食纖維 35%～50%、淀粉 10%～15%、粗蛋白 12%～18%、脂肪3%～5%。由圖1可知，不同溶劑對麩皮提取物得率不同，75%乙醇溶劑得率最高，為10.72%，且與其他組差異顯著。純丙酮得率最低，為1.15%。而蒸餾水組提取物得率較高，可能是因?yàn)榈矸奂按值鞍兹芙廨^多。不同得率反應(yīng)了不同溶劑可提出的可溶性物質(zhì)含量不同。同時也可以看出，純甲醇、純乙醇溶劑提取得率相對較低。整體而言，不同濃度丙酮組提取率較低。

圖1 不同溶劑麩皮提取物得率Fig.1 Extraction rates of bran extracts in different solvents

2.2 不同溶劑麩皮提取物總酚含量及提取能力

一般而言，游離型和結(jié)合型酚類物質(zhì)為可溶性酚類，束縛型酚類物質(zhì)則為不溶性酚類，以酯鍵、糖苷鍵和醚苷鍵等形式與其他物質(zhì)相結(jié)合[17]。由圖 2可知 50%乙醇提取組總酚含量最多，為2.9 mgGAE/100 mg，但與對照蒸餾水組差異不顯著。100%丙酮提取組總酚含量最少，為1.14 mg/100 mg。由圖3可知，蒸餾水的總酚提取能力最強(qiáng)，且與其他各溶劑組差異顯著。50%、75%甲醇提取組和 50%、75%乙醇提取組總酚能力相對較強(qiáng)，且它們之間差異不顯著。100%丙酮提取組最弱。綜合圖2、圖3結(jié)果可知，50%乙醇更適于黑麥麩皮中總酚提取。

圖2 不同溶劑麩皮提取物總酚含量Fig.2 Total phenolic content of bran extracts with different solvents

圖3 不同溶劑麩皮提取物總酚提取能力Fig.3 Total phenolic extraction capacity of bran extracts with different solvents

2.3 DPPH 自由基清除率IC50值和AEC值

DPPH是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，被廣泛應(yīng)用于體外評價天然產(chǎn)物的抗氧化性，尤其是酚類物質(zhì)，通過測定酚酸對DPPH自由基的清除能力可以評估其抗氧化性的強(qiáng)弱[18]。不同溶劑麩皮提取物對 DPPH自由基清除率 IC50值見圖 4，IC50值越低，酚類物質(zhì)對DPPH自由基的清除能力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。由圖 4可知，50%乙醇提取物對DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，但與75%乙醇和75%丙酮組差異不顯著。蒸餾水提取物對DPPH自由基清除能力最弱。

圖4 不同溶劑麩皮提取物對DPPH自由基清除率IC50值Fig.4 IC50 value of DPPH radical scavenging rate of bran extracts with different solvents

從圖 5可看出，50%和 75%乙醇提取物對DPPH的AEC值最高，且與其他組差異顯著。說明其提取效果最好。

圖5 不同溶劑麩皮提取物對DPPH抗氧化物提取能力Fig.5 DPPH antioxidant capacity of bran extracts with different solvents

2.4 ABTS 自由基清除率IC50值和AEC值

由圖 6可知，75%丙酮 IC50值最小，為0.042 mg/mL，所以其提取物對ABTS自由基清除能力最強(qiáng)。而75%甲醇IC50值最大，為0.052 mg/mL，清除能力最弱。但總體而言，各組對ABTS自由基清除率IC50值之間差異并不是很顯著。

圖6 不同溶劑麩皮提取物對ABTS自由基清除率IC50值Fig.6 IC50 value of ABTS radical scavenging rate of bran extracts with different solvents

以ABTS計(jì)的抗氧化物提取能力，其值越高，提取效果越好，由圖7可以看出75%甲醇提取效果最好，且與其他組差異顯著。50%乙醇次之，75%丙酮提取效果最弱。

2.5 相關(guān)性分析

圖7 不同溶劑麩皮提取物對ABTS抗氧化物提取能力Fig.7 ABTS antioxidant capacity of bran extracts with different solvents

為了研究黑小麥麥麩提取物多酚含量及抗氧化性之間的關(guān)系，對各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表 1所示。總酚含量（TP）與 TPEC和AECABTS呈極顯著正相關(guān)，與AECDPPH呈顯著正相關(guān)，說明 TP對 AECABTS影響更大，黑小麥麩皮提取物的抗氧化性主要來源于多酚。TPEC和AECDPPH和AECABTS呈極顯著正相關(guān)，證明溶劑對總酚提取能力的水平與對DPPH和ABTS抗氧化物提取能力一致。

表1 相關(guān)性分析Table 1 Corr elation analysis

3 結(jié)論與討論

可食植物中天然存在的大部分多酚都是以游離或結(jié)合（與多糖或蛋白通過酯鍵和醚鍵）的形式存在[19-20]。在谷物中主要以結(jié)合態(tài)存在形式為主，且80%以上存在于谷物的麩皮和胚乳中[21-22]。游離型酚類化合物通常可直接溶解在有機(jī)溶劑中，所以一般選用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等提取。由于細(xì)胞壁的影響，提取游離型酚類化合物后的殘?jiān)腥杂写罅坎蝗艿姆宇惢衔铮越Y(jié)合型酚類化合物通常是指有機(jī)溶劑提取后的殘留物經(jīng)酸水解、堿水解或酶水解后提取得到的酚類物質(zhì)。

本研究通過提取黑小麥麩皮抗氧化活性成分并對其抗氧化能力進(jìn)行評價。50%乙醇提取總酚含量最高，為2.86 mg/100 mL；蒸餾水總酚提取能力最強(qiáng)，三種有機(jī)溶劑濃度為50%和75%時的提取能力都比純有機(jī)溶劑強(qiáng)，可知黑小麥麩皮多酚屬于中等極性物質(zhì)；50%乙醇 DPPH IC50值最小，對DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，DPPH抗氧化物提取能力 75%乙醇提取效果最佳；75%丙酮ABTS IC50值最小，對ABTS自由基清除能力最強(qiáng)，ABTS抗氧化物提取能力 75%甲醇提取效果最佳；黑小麥麩皮提取物總酚含量及總酚提取能力水平與對DPPH和ABTS抗氧化物提取能力一致。因此，不同溶劑提取物的抗氧化能力不同，綜合比較可知50%乙醇更適于黑小麥麩皮抗氧化活性成分提取。

所以，本研究酚類物質(zhì)提取物主要為游離型酚類化合物，且由于溶劑提取法提取的麩皮多酚粗提液中雜質(zhì)較多，會對其多酚含量及其活性評價造成干擾，因此有必要對其多酚粗提液進(jìn)行純化，去除蛋白質(zhì)和糖分等雜質(zhì)，再結(jié)合其它輔助方法來提高得率，從而得到純度更高的多酚類物質(zhì)，科學(xué)地評價黑麥麩皮多酚的生物活性。