魚腥草水溶性多糖的理化性質及體外抗氧化活性

宋也好，李文娟，尹術華，李 露，吳文英，姚于飛

(1.江西中醫藥大學附屬醫院，江西 南昌 330006；2.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

魚腥草(HouttuyniacordataThunb)又名蕺菜、折耳根，臭豬菜等，為三白草科植物蕺菜的干燥地上部分，最早記載于《名醫別錄》，是我國傳統美食，也是國家衛生部認證的“藥食兩用”的品種之一[1]。魚腥草具有廣泛的生物活性，而多糖為其發揮重要生物活性的成分之一。近年來，隨著對魚腥草相關研究的不斷深入，國內外研究者們發現魚腥草多糖(Houttuyniacordatapolysaccharide，HCP)具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗過敏、消炎抑菌及免疫調節等[2-5]生物活性功能。

HCP的理化性質是研究其活性功能的物質基礎。2011年Tian等采[6]用高效液相色譜技術分析發現HCP由8種單糖組成，且半乳糖和半乳糖醛酸為其主要成分。2013年Cheng B等[7]采用DEAE Sepharose CL-6B和Sephacryl S-400 HR柱分離出分子量為60 kDa且單糖組成只有半乳糖醛酸的純多糖HCP-2，并確定其是半乳糖醛酸殘基構成的果膠類多糖。2018年Kun等[8]從魚腥草中得到相對分子量為21.7 kDa的水溶性果膠多糖HCA4S1，其單糖組成為半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸。2019年Cheng D等[9]從魚腥草水提物中純化出分子量為43 kDa果膠類酸性多糖，其主要單糖也是半乳糖醛酸和半乳糖，且單糖種類與Tian等的研究結果相同。綜上所述，不同分析方法得到的HCP的單糖組成、分子量及理化性質不盡相同，亟需應用先進的實驗手段去驗證并繼續研究HCP的基礎理化特性和活性功能。

因此，本實驗采用水提醇沉法、Sevag除蛋白技術從魚腥草中獲得HCP，綜合運用現代儀器分析技術研究HCP的基礎理化性質(包括中性糖、糖醛酸和蛋白質含量)、分子量、單糖組成、光譜學特性以及固態形貌特征，同時用DPPH自由基和·OH清除法來評價HCP的體外抗氧化活性，旨在為后續HCP精細結構解析及生物活性功能探究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚腥草來源于江西中醫藥大學附屬醫院藥房，江西江中中藥飲片有限公司生產，執行標準：《中國藥典》2015年版一部。

1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH，分析純)(美國Sigma公司)；2,6-二叔丁基對甲苯酚(BHT，分析純)(阿拉丁試劑有限公司)；牛血清蛋白(美國Amersco公司)；考馬斯亮藍G-250、溴化鉀(KBr)(美國Fluka公司)；葡聚糖(Dextran)標準品(T-10、T-40、T-50、T-70、T-500、T-2000)(美國Pharmacia公司)；單糖標準品(L-巖藻糖Fuc、鼠李糖Rha、D-阿拉伯糖Ara、D-半乳糖Gal、D-葡萄糖Glc、D-木糖Xyl、D-甘露糖Man、D-果糖Fru、半乳糖醛酸GalA、葡萄糖醛酸GlcA)(美國Sigma公司)；氯仿、正丁醇、咔唑、苯酚、水楊酸等均為分析純。

1.2 儀器與設備

R-220 SE型旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI公司)；2 L立式冷凍干燥機(美國LABCONCO公司)；TU-1900雙光束紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；Nicolet 5700傅立葉紅外光譜儀(美國Thermo公司)；Dionex ICS 5000離子色譜儀(美國Dionex公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent Technologies公司)；JSM6701F場發射掃描電鏡帶能譜儀(日本電子株式會社)；多功能全自動酶標儀(美國Thermo公司)。

1.3 方法

1.3.1 HCP的提取

稱量粉碎后的魚腥草200 g，用95%乙醇浸泡過夜，過濾后烘干。將已經脫脂處理的魚腥草按照料液比1:20加入超純水，置于恒溫水浴鍋中在95℃條件下攪拌2 h，將過濾后的濾渣重新提取1次，合并兩次濾液于55℃減壓濃縮至原體積的1/5，再加入乙醇沉淀12 h(使乙醇終體積分數達到80%)，離心收集多糖沉淀物。多糖復溶后加入Sevag試劑脫蛋白4次[10](多糖溶液：Sevage試劑=4:1；Sevage試劑=氯仿:正丁醇=4:1 v/v)。除有機溶劑后把多糖溶液裝進孔徑為8 000～14 000 Da透析袋中，用自來水、蒸餾水和超純水分別透析24 h以去除小分子物質。最后旋轉蒸發多糖溶液對其進行濃縮處理，真空冷凍干燥后獲得魚腥草精制多糖。

1.3.2 基本理化性質的測定

計算多糖得率，按公式(1)：多糖得率/%=(多糖質量/原料質量)×100%

(1)

分別用苯酚-硫酸法[11]、硫酸-咔唑法[12]和考馬斯亮藍法[13]測定HCP中的中性糖含量、糖醛酸含量和蛋白質含量。

1.3.3 光譜特性分析

紫外光譜特性分析：將HCP配制成0.1 mg-1的溶液，以去離子水為空白對照，采用TU-1900紫外分光光度計于200～800 nm波長下進行掃描。

紅外光譜特性分析：蘸取微量HCP粉末，在干燥條件下與溴化鉀(KBr)混合研磨并壓制成透光薄片，以KBr作空白對照，使用Nicolet 5700傅里葉紅外光譜儀在400～4 000 cm-1波數下進行掃描[14]。

1.3.4 分子量測定

通過高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)鑒定HCP的純度并測定其相對分子量[15]。將HCP溶解在含0.02%疊氮鈉水溶液中，配制1 mg·mL-1的多糖樣品，過0.22 μm水系濾膜后經Agilent 1260色譜儀進行測定。使用不同分子量葡聚糖標準品(T-10、T-40、T-50、T-70、T-500、T-2000)構建標準分子量與洗脫時間的標準曲線。

色譜條件：配有示差檢測器(RID)和紫外檢測器(DAD2996)，色譜柱為UltrahydrogelTM線性凝膠柱(300 mm×7.8 mm)。流動相為0.02% NaN3水溶液，柱溫箱和示差檢測器溫度均為35 ℃，流速保持在0.6 mL·min-1，進樣量為20 μL。

1.3.5 單糖組成分析

采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培法測定魚腥草多糖的單糖組成[16]。前處理：精密稱量5 mg魚腥草多糖粉末到20 mL具塞試管中，在低溫條件下緩慢加入12 mol·L-1的濃硫酸0.5 mL，在磁力攪拌器下攪拌30 min之后加入2.5 mL超純水，在100 ℃的條件下油浴3 h進行水解處理，待冷卻稀釋一定倍數后過0.22 μm水系濾膜，進樣分析。選取10種單糖標準品(L-巖藻糖Fuc、鼠李糖Rha、D-阿拉伯糖Ara、D-半乳糖Gal、D-葡萄糖Glc、D-木糖Xyl、D-甘露糖Man、D-果糖Fru、半乳糖醛酸GalA、葡萄糖醛酸GlcA)配制成混合標準品，作為標準對照。

離子色譜條件：配有脈沖安培檢測器(PDA)，色譜柱為CarboPacTMPA20保護柱(3 mm×150 mm)和CarboPacTMPA20分析柱(3 mm×30 mm)串聯使用。流動相分別是250 mM NaOH溶液(A)、1 M NaOAc溶液(B)和超純水(C)，流速為0.5 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，按照一定的梯度洗脫程序進行洗脫。梯度洗脫程序如表1所示：

表1 離子色譜法梯度洗脫程序表

1.3.6 SEM分析

將HCP固體復溶后配成1.0 mg-1水溶液，重新冷凍干燥成疏松結構后，蘸取微量于導電膠上，進一步進行噴金處理提高導電性，使用JSM6701F場發射掃描電鏡于2000×，10 000×倍數下對樣品進行掃描觀察其形貌特征。

1.3.7 抗氧化活性研究

1.3.7.1 對DPPH自由基的清除能力

參照Chen等[17]的實驗方法并進行略微修改來測定HCP對DPPH自由基的清除能力。方法：采用BHT為陽性對照組，配置一定濃度梯度(0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 mg-1)的多糖和BHT樣品溶液，加入DPPH(0.1 mmol·L-1)試劑，混勻后于37 ℃恒溫箱中避光反應30 min，取200 μL溶液轉移至96孔板中，用酶標儀在517 nm下測定其吸光度值，每個樣品平行測定3次。用式(2)計算DPPH自由基清除率。

A1：0.2 mL樣品溶液+0.5 mL DPPH

A2：0.2 mL樣品溶液+0.5 mL 95%乙醇

A0：0.2 mL去離子水+0.5 mL DPPH

清除率/%=(A0-A1+A2)/A0×100%

(2)

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為樣品對照組吸光度。

1.3.7.2 對羥基自由基(·OH)的清除能力

參照Bi等[18]測定方案并進行適當調整來測定HCP對·OH的清除能力。方法：以BHT作為陽性對照組，配置一定濃度梯度(0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 mg·mL-1)的多糖和BHT樣品溶液，依次加入硫酸亞鐵(FeSO4，9 mmol·L-1)和過氧化氫(H2O2，6 mmol·L-1)溶液混勻后，在37℃避光反應10 min，然后加入水楊酸(9 mmol·L-1)繼續在37 ℃避光反應30 min，待反應完全之后吸取200 μL溶液轉移至96孔板中，用酶標儀在510 nm下測定吸光度值，每個樣品平行測定3次。用式(3)計算·OH清除率。

A1：0.2 mL樣品溶液+0.2 mL FeSO4+0.2 mL H2O2+0.2 mL水楊酸

A2：0.2 mL樣品溶液+0.2 mL FeSO4+0.2 mL去離子水+0.2 mL水楊酸

A0：0.2 mL去離子水+0.2 mL FeSO4+0.2 mL H2O2+0.2 mL水楊酸

清除率/%=(A0-A1+A2)/A0×100%

(3)

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為樣品對照組吸光度。

2 結果與分析

2.1 得率和基本理化性質分析

HCP凍干后是易溶于水的褐色疏松固體。如表2所示，由本實驗室提取的HCP的得率約為2.79%，與前人的文獻報道相比較低，原因可能是脫蛋白四次會損耗部分糖液，從而降低提取率。基礎理化數據顯示，HCP的總糖含量達到了91.6%(中性糖含量和糖醛酸含量的總和)，糖醛酸的含量達到51.11%，蛋白質含量為3.16%，說明該多糖為酸性多糖且可能含部分結合蛋白。

表2 HCP的得率和基本理化性質

2.2 光譜特性分析

將HCP在紫外檢測器工作波長200～800 nm掃描后，其紫外光光譜圖如圖1所示，發現HCP在280 nm波長左右處有蛋白質吸收的特征峰，說明該糖含有蛋白質成分。通過紅外光譜掃描法可初步解析多糖的特征官能團構成。觀察圖2可知：3 356 cm-1處有較寬的強吸收峰是-OH的伸縮振動，屬于糖類的特征吸收峰。多糖中甲基類的-CH伸縮振動吸收峰在2 933 cm-1左右處有吸收。1 427 cm-1處的吸收應該是糖類的-CH變角振動產生的。上述三個峰為多糖共有的吸收峰，由此可確定其為多糖[19]。1 743～1 631 cm-1附近的吸收可能為羧基中的C=O的不對稱伸縮振動，也是糖醛酸的特征吸收峰[20]。800～1 200 cm-1之間的區域被稱為碳水化合物的指紋區域，給樣品的結構差異提供了良好指示。1 100～1 018 cm-1之間的強吸收應為C-O和C-O-C的伸縮振動，為吡喃糖環吸收峰[21]。900～700 cm-1為糖類的環振動吸收區，其在828 cm-1的弱吸收可能為α-D-半乳吡喃糖或β-D-阿拉伯吡喃糖的特征吸收峰[22]。上述紅外光譜圖分析結果表明HCP是一種綴合蛋白的果膠類酸性多糖，且具有吡喃糖結構。

2.3 純度及分子量分析

HPGPC法是按照高聚物分子量的尺寸以及大小進行逐級分離的，分子量大的高聚物先出峰，而分子量小的高聚物后出峰。HCP的HPGPC見圖3，觀察發現其在10～16 min之內只有單峰出現且對稱性較好，由此得知HCP為純度較高的均一組分。圖中多糖洗脫時間是12.791 min，依據葡聚糖標準品曲線方程計算得到HCP的重均相對分子量為3.87×105Da。

2.4 單糖組成分析

混合單糖標準品和HCP水解樣品的離子色譜圖見圖4，分析可知該多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸這8種單糖組成，經計算得其物質的量比為6.44：

8.98：16.32：10.32：3.32：1.80：39.12：1.00。如表3所示，經酸水解的HCP樣品中，半乳糖醛酸的含量最高，為15.57%，其次是半乳糖和葡萄糖，也再次驗證了HCP為酸性的果膠類多糖。HCP經水解后的糖含量顯著低于常規化學方法測定的糖含量，因為該方法不能完全將HCP水解為單糖，可能是由于糖醛酸之間的糖苷鍵更加難以斷裂[23]。

表3 HCP的單糖組成

2.5 SEM分析

掃描電鏡主要是根據電子束與試樣表面物質相互作用產生效應，并放大樣品結構圖像從而獲得樣品的形貌信息，可作為表征多糖性質的一種定性工具[24]。HCP在掃描電鏡下被放大2 000和10 000倍的固態形貌如圖5所示，由圖可知其主骨架為條桿狀物質，部分絲狀物質相互纏繞成非均勻的網狀結構，還有少量球狀物質通過細絲附著桿狀物質表面，使HCP呈現蓬松質輕的表觀形態。

2.6 抗氧化活性分析

DPPH自由基在醇溶液中穩定存在時呈現紫色，遇到抗氧化物時可使DPPH自由基孤對電子被配對而導致溶液變成淡黃色[25]，這是評價抗氧化程度的典型指標之一。HCP清除DPPH自由基的能力如圖6所示，當HCP質量濃度在0.1～0.8 mg-1范圍內時，多糖質量濃度與DPPH自由基的清除能力幾乎呈現正比例上升狀態。當多糖質量濃度達到1.6 mg-1時，HCP清除DPPH自由基的能力接近峰值達到87.18%，與BHT的清除效率基本相當，說明HCP對DPPH自由基的清除效果強。HCP的清除自由基的作用機制可能是多糖的某些功能基團可與自由基相互作用，終止相應的自由基鏈反應，形成穩定的聚合物分子，起到抗氧化保護作用[26]。

·OH是一種具有很強的得電子能力且其活性僅次于氟的活性氧自由基，它可以穿過細胞膜作用于蛋白質、脂質、核酸等生物分子引起氧化損傷導致細胞凋亡從而引發衰老等各種疾病[27]。因此，清除有害的·OH可以保護機體正常生命活動。HCP對·OH的清除效果見圖7，由圖可知HCP質量濃度與清除·OH的效率呈現一定的量效關系，清除率隨著劑量的增加而上升。當HCP濃度為0.1 mg-1時，對·OH清除效率較低為7.46%。當HCP質量濃度達到1.6 mg-1時，對·OH的清除率上升至31.37%，但是與BHT對照組相比，其抗氧化能力相對較弱。HCP的抗氧化作用機理可能是多糖鏈上可產生游離的氫原子，然后與·OH結合生成水，從而達到清除·OH作用；也有可能是多糖中的糖醛酸與Fe2+產生耦合作用從而抑制自由基產生，提高還原力[28]。

3 結論

天然產物來源多糖的結構與功能研究在食品、保健品以及藥品等領域已經成為一大熱點[29]，特別是來源豐富的食源性多糖具有良好的應用價值和市場開發前景。現代研究證實HCP具有消炎鎮痛、抗病毒和腸道保護等活性功能[30]，因此其基本結構特征的研究具有重要意義。本實驗采用水提醇沉法并經脫蛋白處理后從魚腥草中提取出水溶性多糖并對其理化性質進行了比較全面的測定，結果發現HCP是一種重均相對分子量為3.87×105Da的均一酸性果膠類多糖，且總糖含量高達91.62%(其中糖醛酸含量為51.11%，中性糖含量為40.51%)。HCP的單糖組成主要為半乳糖醛酸和半乳糖，主要由絲狀、桿狀和球狀物質組成，并且對DPPH自由基和·OH呈現較好的清除效果。本研究可為后續深入探究HCP精細結構信息和活性功能奠定了一定的基礎，有利于魚腥草資源的綜合利用與開發。