大氣NO2濕沉降對桑樹葉片光系統的影響

夏凡育，鄭美慧，李曉娜，王彥力，王 月

(東北林業大學生命科學學院，哈爾濱 150040)

0 引言

目前普遍認為NO2為一種具有一定毒性的氣態大氣污染物[2,4,5]，但從NO2對植物生理生態的影響方面來考慮，不同濃度NO2對不同植物的影響有差異，同時植物對其的應答機制也是復雜的[13]。一些研究已經闡明，較高濃度水平的NO2對植物生理代謝有著不利影響，但一些研究同時也表明，NO2濃度的適度提高可促進植物生長[14-16]。相關試驗也證明了NO2可以作為氮源參加氮代謝途徑，但同時也可以作為信號分子來調控植物體的相關生理活動[16]。基于此，對于大氣NO2沉降對植物的生理生態學研究不能單純著眼于相關逆境應答機制的探索，也要針對植物對NO2的相關代謝過程做好定量與定性的深入研究。

桑樹(Morusalba)系屬桑科桑屬落葉喬木或灌木，是一種經濟效益與生態效益俱佳的優良樹種[17]，在我國分布廣泛。桑樹具有良好的溫度耐受力與水分耐受力，環境適應性很強，生態幅較大，可作為先鋒樹種進行環境植被修復[18-19]。傳統的桑樹開發主要集中于紡織與中藥領域，但現今對于桑樹價值的開發較以往更加多元。桑葉飼料的營養價值較傳統飼料更占優勢[20]，一些研究還發現桑葉和桑葚有調節免疫功能、抗氧化等效用，具有一定的藥理活性功效[21]。因此，桑樹不但具有良好的生態效益，也是我國飼料工業和食品工業中重要的原料樹種、經濟樹種[18-22]。

一些研究已經證明，桑樹對酸雨的適應性較強[23]，相關報道也說明了NO2熏蒸桑樹可在一定程度上促進桑樹的光合與生長發育[24]。但大氣氮素通過濕沉降途徑對桑樹產生的相關影響研究仍未深入。為研究大氣NO2濕沉降對桑樹葉片光合特性的影響，以黑龍江省推廣的耐鹽堿桑樹品種“秋雨桑”為材料，以不同濃度的NH4NO3對桑樹葉片進行噴施處理，并探討NO2濕沉降逆境脅迫對桑樹光合特性的相關系列影響機制，其結果可為植物對大氣NO2多途徑沉降的應答機制以及NO2進入植物體后的代謝過程研究提供相關數據或證據，以期為農業生產與環境評估提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年6月—11月在東北林業大學植物生理實驗室進行，供試桑樹品種為黑龍江省推廣種植的主栽品種——秋雨桑，種子由黑龍江省蠶業研究所提供。發芽培育后，待供試苗木生長到20 cm時，移栽到直徑12 cm、高15 cm的培養缽中。為保證試驗材料的相對一致性，在移植時去掉桑樹幼苗分支和葉片，只保留主根和主莖各5 cm。每缽定植2株，共計60株。培養基質由草炭土和蛭石均勻混合而成，待供試苗木生長到30～40 cm時，選用長勢一致的桑樹幼苗進行模擬NO2濕沉降處理。

1.2 試驗方法

為模擬NO2濕沉降，取NH4NO3[10，25]溶于水。根據相關研究[26]，本試驗設置3個氮沉降梯度[26]，分別為20 mmol/L(D20)、35 mmol/L(D35)、50 mmol/L(D50)，另以清水對照組(CK)。為排除NO2濕沉降對桑樹根系的影響，在噴施時用塑料布將盆體上層浮土覆蓋，以減少根系吸收。考慮到氣孔分布因素，同時對桑葉片正反面噴施酸雨，直到重度脅迫處理葉片出現病癥時開始檢測各指標項目。每個處理梯度設置5次重復。

1.3 測定項目及方法

利用M-PEA型植物效率儀(Hansatech，英國生產)測定30 min暗適應后的桑樹幼苗葉片第3片完全展開葉片的葉綠素熒光動力學曲線(OJIP曲線)和820 nm光吸收曲線。在OJIP曲線測定過程中，誘導光強為3 000 μmol·m-2·s-1的脈沖紅光。從10 μs開始記錄相對熒光強度(Fv)，至2 s結束，其中曲線上O、J、I和P點分別表示當時間為0、2、30和1 000 ms時曲線上對應的點。參照Stasser[27]的計算方法進行JIP-test分析，測定PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)、PSⅡ潛在光化學活性(Fv/Fo)、光能吸收性能參數(PIABS)、PSII受體側QA的積累(VJ)、PQ 庫的異質性(VI)、QA氧化還原次數(N)、光化學反應集聚能量 (ABS/RC)、QA氧化還原反應消耗能量 (TRo/RC)、光化學反應中心捕獲的用于電子傳遞能量 (ETo/RC)、光化學反應消耗能量 (DIo/RC)和單位面積有活性的反應中心數目(RC/CSm)。PSⅠ反應中心活性通過820 nm光吸收的最大值(Io)與最小值(Im)差值的相對值來表示，即△I/Io=(Io-Im)/Io。

1.4 數據分析

運用Microsoft Excel(2010)和DPS(7.05)軟件進行數據統計分析，使用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異分析(LSD)方法進行數據組間的差異分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片OJIP曲線的影響

在不同濃度梯度處理下，桑樹葉片OJIP曲線形態發生了較為明顯的變化。在O點，各組的相對熒光強度變化并未出現顯著性差異，但在分析各組J點、I點和P點時，不同的濃度，組間變化非常明顯，其中I點和P點變化較為顯著。定量分析發現：D20組的J點、I點和P點3點皆高于CK組；D35組的J點、I點和P點3點皆低于CK組；D50組的J點、I點和P點同樣均低于CK組，但較D35的3點明顯處于相對更低的熒光水平。

圖1 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片OJIP曲線的影響Fig.1 Effects of different concentrations of NO2 wet deposition on OJIP curves of mulberry leaves

2.2 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片PSI活性參數ΔI/Io的影響

從圖2可以明顯看出，不同處理組的820 nm光吸收值差異明顯，即PSI活性參數變化較為明顯。在低濃度處理下，葉片PSI活性較CK明顯提高，D20組的ΔI/I0值明顯高于對照組(CK)，幅度較比CK增長了36%(P<0.01)。而在高濃度處理下，D35、D50組的PSⅠ最大氧化還原能力均低于CK，且在所設置的最高濃度組D50組中下降最為顯著，兩組中D35組較CK下降幅度為21.8%(P<0.01)、D50組較CK下降幅度為40%(P<0.01)。在高濃度NO2濕沉降處理下，植物葉片光系統的PSⅠ活性受到了一定程度的抑制，但相對于兩個高濃度處理組，在低濃度NO2濕沉降處理下，植物葉片的PSⅠ活性明顯受到了促進。

圖2 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片PSI活性參數ΔI/Io的影響Fig.2 Effects of wet deposition of different concentrations of NO2 on PSI activity parameters ΔI/Io of mulberry leaves

2.3 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片Fv/Fm、Fv/Fo、Fo/Fm和PIABS的影響

圖3表明，在經過NO2濕沉降處理后的桑樹葉片上，其Fv/Fm、Fv/Fo、Fo/Fm、PIABS發生了一定程度的變化。與CK相比，D20處理組的Fv/Fm、Fv/Fo、PIABS3個參數各增長了4.2%(P>0.05)、16.2%(P<0.01)和78.8%(P<0.01)，而兩個高濃度處理組的Fv/Fm、Fv/Fo、PIABS3個參數均低于CK組，且D50組下降程度明顯高于D35組，可以看出Fv/Fo、PIABS變化程度較為顯著，Fv/Fm同樣產生變化，但整體幅度并不明顯。上述變化反映了葉片PSⅡ的光化學活性受到了抑制，從而抑制了光化學反應，降低了PSII最初光能轉換效率以及電子傳遞速率，導致原初反應受到抑制，說明低濃度NO2濕沉降處理對PSⅡ反應中心活性具有促進作用，但在相對高濃度時，抑制了反應中心活性。

圖3 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片Fv/Fm、Fv/Fo、Fo/Fm、PIABS的影響Fig.3 Effects of different concentrations of NO2 wet deposition on Fv/Fm,Fv/Fo,Fo/Fm and PIABS of mulberry leaves

2.4 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片Area、VJ、VI、Sm、N的影響

Area可代表PSⅡ受體側PQ庫對電子接受能力的大小，各組材料的電子接受能力為D20>CK>D35>D50。VJ在不同濃度處理下所表現出的變化不同。高濃度處理相對于CK抑制了反應中心的開放，但低濃度下有效促進了反應中心的開放程度。VI代表電子經過QB時的能量耗散比率，由圖4可知，只有D35組相較于CK上升了3.7%(P>0.05)，而其他兩個處理組皆低于對照組。Sm表示質體醌庫大小，可以看出隨著處理濃度的提高，整體質體醌庫大小隨濃度呈現正比例關系，D50>D35>D20>CK，N的變化較為明顯，隨著處理濃度的增加，各組均呈現高于CK對照組的情況，其中D50>D35>D20>CK。

圖4 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片Area、VJ、VI、Sm、N的影響Fig.4 Effects of different concentrations of NO2 wet deposition on Area,VJ,VI,Sm and N of mulberry leaves

2.5 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、ETo/RC的影響

ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、ETo/RC是4個重要的單位反應中心比活性參數。圖5表明，經NO2濕沉降處理后的桑樹葉片QA處于可還原態時，PSⅡ反應中心傳遞情況隨濕沉降處理濃度的改變同樣產生了變化。低濃度水平下，單位反應中心吸收的光能(ABS/RC)、用于還原QA的能量(TRo/RC)、用于電子傳遞的能量(ETo/RC)及耗散的能量(DIo/RC)均變小，而在高濃度水平下，各部分捕獲或耗散的能量較低濃度處理組開始升高，其中除ETo/RC外，普遍高于CK。低濃度D20組的ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、ETo/RC較CK數據水平分別降低了34.1% (P<0.01)、42.0% (P<0.01)、30.4%(P<0.01)、20.6%(P<0.01)。而高濃度組的相關數據較D20組顯著升高，并且隨著處理濃度的加大，能量流參數值升高程度也隨之提升，普遍呈現出D50>D35>D20的情況。

圖5 不同濃度NO2濕沉降對桑樹葉片ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、ETo/RC的影響Fig.5 Effects of different concentrations of NO2 wet deposition on ABS/RC,DIo/RC,TRo/RC and ETo/RC of mulberry leaves

3 討論

通過整個試驗發現NO2濕沉降處理下NO2處理濃度與葉片光合特性的關系，在相對低濃度處理時呈現促進光合現象，在相對高濃度處理時呈現抑制光合現象。

葉綠素熒光與植物的原初反應關系密切，為了解植物PSⅡ原初反應相關情況，對樣品進行了快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(OJIP曲線)及JIP-Test分析[28]。通過OJIP曲線形狀可以看出，曲線形狀在不同濃度處理下發生的變化較為顯著，PSII的結構和功能受到了不同處理條件的影響。整體來看，較比CK曲線，在低濃度濕沉降處理下，20 mmol/L(D20)處理組有相對更高的曲線，說明植物葉片的原初反應呈現更加活躍的趨勢，這與劉會芳等人[29]的結果類似。而在高濃度處理時，整體原初反應受到抑制，這與王月等人[23]和胡月等人[30]的試驗結果較為相似。在Fv/Fm、Fv/Fo、Fo/Fm等數據中，樣品的整體最大光化學效率浮動幅度并不明顯，這表明了光系統II 反應中心的先增進活性再抑制活性的過程。Vj反映了PSII有活性反應中心的關閉程度，與對照植物相比，低濃度下Vj明顯下降，可初步證明PSII反應中心的活性和反應中心的開放程度得到了加強，這一點亦可從OJIP曲線J點前部分得到證明。D20組具有更小的熒光信號，反應中心的開放促進了葉片的電子傳輸，從而加速了NADPH和ATP的合成以及轉化。胡彥波等人對楊樹研究發現[31]，高濃度NO2熏蒸所模擬的NO2干沉降處理抑制了葉片的最大光化學效率。而本試驗中，隨著處理濃度加大，不同濃度處理組的性能指數PIABS表現不同，低濃度處理組(D20)的性能指數和CK相比提高，而高濃度處理組的性能指數相對于對照組明顯下降，可見高濃度濕沉降處理下的桑樹的光合性能明顯受到了抑制。

一般認為，植物在逆境情況下，其光系統會產生不同程度的光抑制[32-33]，而在光系統Ⅰ中，PSⅠ最大氧化還原能力是目前經常用來討論PSⅠ功能活性的重要參數[34-35]。王帥等人發現，在氮肥施加下，可以提高玉米的PS1活性參數ΔI/I0，但高濃度的效果差于低濃度[36]。在本試驗中可以看到，PSⅠ的功能活性呈現低濃度促進、高濃度抑制的趨勢，高濃度的處理會造成反應中心的功能性衰減。PSⅠ和PSⅡ之間存在著連續性作用[37]，相關研究也證實了PSⅠ的活性受PSⅡ影響較大[37]，且有研究表明PSⅡ活性下降時，PSⅠ的光抑制現象可以得到緩解[38]。但本試驗中，低濃度組的PSⅠ活性仍呈高位，說明低濃度處理組在電子傳遞增加的情況下，處理條件增強了PSⅠ反應中心的功能活性。而在高濃度處理時，盡管電子傳遞能力變弱，但PSⅠ的反應中心卻產生了損傷，導致最大氧化還原能力下降。

ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC、ETo/RC是反應中心比活性參數，可以用來討論反應中心能量流的大小[28]。其中，整體呈現出低濃度組低于對照，而高濃度區間高于對照且呈現正比例關系。低濃度組下各項指標的下降原因，結合活性參數分析，該濃度下整體光合效率較比CK得到了提升，而在光系統活性與開放程度皆得到提升的情況下，吸收的光能更多地用于光合作用，所以使得整個系統呈現出一種低耗能高效率的運行狀態；而高濃度組則恰恰相反，整體光系統的活性與光合效率由于受到反應中心功能活性的抑制或破壞，同時也存在著與碳同化產生競爭性抑制的可能，故呈現出高耗能低效率的能量利用情況。

模擬NO2濕沉降對電子傳遞情況也產生了顯著影響。在Vj與Vi上升時，電子傳遞鏈中電子傳遞受阻[39]；PSⅡ電子鏈受體側的變化可以在Area中反映出來[40-41]，但Area的變化卻呈現低濃度高水平。而高濃度低水平的現象；PIABS光合系統性能指數既可以反映原初光化學量子產額，也可反映出反應中心的密度、電子在PSI和PSII間的傳遞情況以及光系統的活性。很多時候，當Fv/Fm未出現明顯波動時，PI參數已經發生很大變化[42]。可以看到，Sm(質體醌庫)隨濃度不斷升高；N，即QA周轉次數的變化呈現先低后高的態勢；高濃度處理下的PS I和PS II間的電子傳遞顯著降低，這說明了電子傳遞鏈的受體側已經出現抑制甚至破壞現象。

4 結論

本試驗說明了大氣NO2濕沉降對桑樹葉片光合特性的影響非常明顯，但不同濃度的濕沉降對植物的影響效應不同。在低濃度下呈現出促進光合的現象，主要因低濃度濕沉降處理條件促進了光系統Ⅰ和光系統Ⅱ的活性以及反應中心的開放程度，而在高濃度下則導致抑制光合現象的出現，這是由于反應中心活性受到抑制、光合反應中心開放程度減小、電子鏈傳遞能力降低所導致。可以初步證明，大氣NO2濕沉降對桑樹的光合特性具有高抑制、低促進的兩重性。