硒對油菜根際土壤微生物的影響

程勤，胡承孝，明佳佳，蔡苗苗，劉康，湯艷妮，趙小虎

（華中農業大學資源與環境學院/微量元素研究中心/新型肥料湖北省工程實驗室/土壤環境與污染修復湖北省重點實驗室，武漢 430070）

植物根際微生態環境中，微生物顯著影響著“土壤-植物”系統中礦質元素的生物有效性及植物生長環境的健康狀況[1-3]。微生物群落的功能與群落的結構和多樣性密切相關[4-5]。任何影響根際土壤微生物群落結構與多樣性的因素，都會影響到群落的功能，進而影響到植物的健康生長。因此，研究根際微生物群落結構與多樣性變化，有助于理解外界因素促進植物健康生長的根際過程。

硒是人體必需的微量元素，也是植物的有益元素。土壤中施用適量硒有助于植物生長，增強植物抗逆能力[6-8]。此外，土壤環境中，適量硒可直接或間接抑制白腐真菌（Phanerochaete chrysosporium）、青霉菌（Penicillium expansum）、核盤菌（Sclerotinia sclerotio?rum）等多種病原微生物的生長[9-12]。有關硒與微生物生態的研究結果表明，硒可顯著改變土壤微生物的群落結構及其多樣性[13]。低濃度硒可提高土壤微生物的數量和多樣性，高濃度硒則表現出抑制效果[14]。不同硒含量土壤的微生物群落特征及多樣性與土壤性質等因素密切相關[15-16]。

前期研究發現：向土壤中施用適量硒顯著提高了油菜體內礦質元素的含量，促進了油菜的生長；恩施地區油菜主產區土壤微生物群落與硒含量密切相關[17-18]。綜合上述研究結果及其他研究報道推測，土壤施硒促進植物生長與硒改變根際微生物群落組成進而影響土壤微生態環境有關。為明確外源硒對根際土壤細菌及真菌群落的影響，進而評價其土壤生態安全性，本研究基于高通量測序技術，分析了土壤微生物群落的結構與多樣性對外源硒的響應，以期從微生物生態調控的角度，研究硒與植物生長的關系，為進一步評價農田施硒對土壤微生態安全的影響提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試油菜品種為中國農業科學院油料作物研究所培育的中雙9號。

1.2 試驗設計與處理

盆栽試驗在華中農業大學微量元素中心盆栽場（30°28′26″N，114°02′15″E）完成。土壤類型為酸性黃棕壤，種植油菜前采樣分析測定其基本理化性質如下：pH 4.8，有機質含量21.2 g·kg-1，堿解氮、有效磷、速效鉀含量分別為69.73、29.87、47.64 mg·kg-1，土壤全硒含量12.37 μg·kg-1。試驗以亞硒酸鈉（Na2SeO3）作為硒源，共設置3 個處理，土壤施硒濃度依次為0（CK）、0.5、1.0 mg·kg-1，分別記為Se0、Se0.5 和Se1.0（土壤硒濃度參照本團隊前期相關研究結果設定），每個處理3 次重復。在油菜播種前，將所有營養元素配成溶液施入土壤，其中，N、P、K 元素的施用量分別為N 0.2 g·kg-1、P2O50.15 g·kg-1、K2O 0.2 g·kg-1，營養元素來源分別為尿素、磷酸二氫銨和硫酸鉀。微量元素以每千克土壤中加入1 mL 阿農營養液（1 000 倍）補充。先將硒配制成一定濃度的溶液，施入土壤后迅速拌勻。油菜按照當地播種時間于2017 年9 月16 日播種。植物生長期間以去離子水作為水源。將盆栽放置于防雨棚下防止雨水中微量元素對試驗的污染。

1.3 根際土壤樣品采集

根際土壤于2018 年3 月15 日（油菜花期）采用抖根法收集，即從盆栽土壤的20～50 cm 土層選取帶完整根系的土塊，然后輕輕抖落，緊附在根系表面且不易被抖落的土壤即為根際土壤。再去掉土壤中的根系和小石塊，過2 mm篩后將土樣裝于無菌封口袋中，冰上放置帶回實驗室后保存在-80 ℃冰箱中。

1.4 根際土壤微生物總DNA提取和高通量測序

取0.5 g 根際土壤樣品，采用土壤DNA 試劑盒（MOBIO，美國）提取油菜根際土壤微生物總DNA。以紫外分光光度法測定提取的DNA 純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后用于構建文庫。以提取的總DNA 為模板，以細菌V4 區特異性引物（338F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[19]和真菌ITS2 區特異性引物（ITS2 F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；2043R 5′-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）進 行PCR 擴增[20]。采用Illumina MiSeq 測序平臺對PCR 擴增產物進行測序分析。土壤樣品的微生物測序及數據分析由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.5 數據處理與分析

原始測序數據經去除接頭序列和低質量的堿基處理后，獲得高質量序列。通過Flash 軟件對每個樣品的Reads 進行拼接，按照堿基數對Tags 進行截斷和過濾并與數據庫進行比對，得到最終的有效數據。利用QIIME 軟件（V1.9.1）對序列進行識別，再利用USEARCH 選出優質序列后，以97%的序列相似度將序列聚類成操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU），將選取出的OTU 代表序列與16S rRNA 數據庫和ITS 數據庫進行物種注釋后開展后續的測序數據分析。

2 結果與分析

2.1 硒對油菜根際土壤微生物群落結構的影響

通過計算不同硒處理土壤樣品中細菌和真菌在門水平上的物種平均相對豐度，同時選取相對豐度在1%以上的物種，繪制了門水平上的物種相對豐度分布圖（圖1）。由圖1A 可知，油菜根際土壤中細菌相對豐度較大的門類為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和酸桿菌門（Acidobacteria）等。硒處理（0.5、1.0 mg·kg-1）增加了土壤酸桿菌門（Acidobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的豐度，降低了放線菌門（Actinobacteria）的豐度。由圖1B可知，土壤中真菌相對豐度最大的門類為子囊菌門（Ascomycota），硒處理（0.5、1.0 mg·kg-1）增加了土壤子囊菌門（Ascomycota）的相對豐度。

圖1 不同施硒濃度下油菜根際土壤細菌（A）和真菌（B）在門水平上的相對豐度Figure 1 The relative abundances of bacterial（A）and fungal（B）phyla in the rhizosphere soil of oilseed rape under different selenium treatments

Venn 圖展示了不同濃度硒處理組土壤微生物群落共有或特有的OTU 數，進而分析了各處理間微生物群落結構的相似性、重疊情況以及特異性（圖2）。由圖2A 可知，硒處理土壤中細菌群落共有OTU 個數為670，而Se0、Se0.5 和Se1.0 處理土壤細菌群落特有的OTU 個數分別為213、117和113。由圖2B 可知，硒處理土壤中真菌群落共有OTU 個數為48，而Se0、Se0.5 和Se1.0 處理土壤真菌群落特有的OTU 個數分別為5、8和14。結果表明，對照組（無外源硒處理組）根際土壤細菌群落結構最為復雜，特異性最高，硒處理降低了土壤細菌群落結構的特異性，增加了土壤真菌群落結構的特異性。

2.2 硒對油菜根際土壤微生物群落Alpha多樣性的影響

Alpha 多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析。本研究中，以Shannon 指數和Simpson 指數表示樣本中微生物的多樣性，前者數值越大或后者數值越小，表明群落多樣性越大。Chao1 指數可表征微生物群落豐富度，該指數的大小與微生物群落豐富度大小相對應。由表1 可知，土壤施硒對油菜根際土壤細菌和真菌群落Shannon 指數和Simpson 指數的影響均未達到顯著水平，但顯著降低了土壤細菌群落的Chao1指數，對土壤真菌群落的Chao1 指數影響不顯著。土壤微生物群落Alpha 多樣性分析結果表明：硒的施用未顯著改變油菜根際土壤樣品中微生物的多樣性，降低了土壤細菌群落的豐富度。

圖2 不同施硒濃度下油菜根際土壤細菌（A）和真菌（B）OTU Venn圖Figure 2 The Venn diagram of bacterial（A）and fungal（B）OTU in the rhizosphere soil of oilseed rape under different selenium treatments

表1 不同施硒濃度下油菜根際土壤細菌和真菌多樣性與豐富度Table 1 The diversity and richness of bacteria and fungi in the rhizosphere soil of oilseed rape under different selenium treatments

2.3 硒對油菜根際土壤微生物群落Beta多樣性的影響

圖3 不同施硒濃度下油菜根際土壤細菌（A）和真菌（B）PCoA分析Figure 3 PCoA analysis of bacteria（A）and fungi（B）in the rhizosphere soil of oilseed rape under different selenium treatments

根據樣本的OTU 豐度信息計算Unweighted Unifrac 距離，對土壤細菌和真菌群落進行主坐標分析（Principal coordinate analysis，PCoA），評價硒對油菜根際土壤微生物群落結構的影響（圖3）。由圖3 可知，不同施硒濃度中的3 個重復并不聚類于同一象限，表明組內變異較大。由圖3A 可知，PC1 軸上Se0.5、Se1.0 處理集中分布在正方向，Se0 處理分布在負方向，Se0 與Se0.5、Se1.0 之間差異顯著，Se0.5 和Se1.0 之間差異不顯著，說明影響土壤細菌群落結構的主導因子較為明顯。由圖3B 可知，PC1 軸上Se0、Se0.5、Se1.0 處理集中分布在正方向；Se0、Se0.5、Se1.0處理間的差異不顯著，表明影響土壤真菌群落結構的主導因子并不明顯。基于Bray-Curtis距離進行Adonis分析，結果表明：硒對土壤細菌群落結構影響顯著（R2=0.346，P=0.044）；硒對土壤真菌群落結構影響不顯著（R2=0.294，P=0.324）。綜合土壤微生物群落Beta多樣性結果可知，硒對土壤細菌群落的影響比真菌群落更為明顯。

2.4 硒對油菜根際土壤微生物群落差異物種特征的影響

分析不同施硒濃度下土壤細菌和真菌群落的差異物種特征，對評價土壤硒與微生物多樣性的關系十分重要。本研究對三個濃度硒處理土壤間的細菌群落采用線性判別分析（Linear discriminant analysis，LDA），估算了硒處理下物種豐度對差異效果影響的大小。分析結果見顯著差異物種LDA 值分布柱狀圖（圖4），該圖反映了每個組內顯著富集的物種及其差異影響。由圖4 可知：未施硒的油菜根際土壤中顯著富集乳桿菌目（Lactobacillaceae）、德庫菌屬（Trichococcus）、肉桿菌科（Carnobacteriaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、紅長命菌屬（Sphaerotilus）；Microtrichales顯著富集于低濃度硒處理土壤中；而產黃桿菌（Rhodanobacter）、Nitrolancea、熱微菌科（Thermomicrobiaceae）和無色桿菌屬（Achromobacter）則顯著富集于高濃度硒處理土壤中。

圖4 不同施硒濃度下油菜根際土壤細菌存在顯著差異物種的LDA值分布柱圖Figure 4 Histogram of LDA value distribution of species with significant difference between bacteria in the rhizosphere soil of oilseed rape under different selenium treatments

3 討論

土壤微生物在土壤-植物生態系統中具有關鍵作用。植物在生長過程中與土壤微生物密切接觸，其根系可塑造根際土壤微生物群落[21-23]。與此同時，根際微生物群落中的有益微生物如叢枝菌根真菌（AMF）和植物生長促生菌（PGPR），有助于增強植物對營養元素的吸收，促進植物生長，增強其對病原菌的抵抗能力[24]。根際微生物群落結構和多樣性可通過“土壤-植物”互作系統直接影響到植物生長的微生態環境。任何影響土壤微生物生態的外源因素都可能間接影響植物的生長與安全。

本研究基于前期研究發現的“硒維護植物良好生長環境，促進植物對礦質養分的吸收”等相關結果，結合根際微生物生態功能，研究了硒作用下土壤微生物群落的結構與多樣性的響應。研究發現，本試驗油菜根際土壤中細菌相對豐度較大的門類為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）等。于冰[25]研究表明，變形菌門對多種植物根際微環境（如：擬南芥、玉米、枸杞等）具有良好的適應能力，酸桿菌門能夠降解復雜的木質素和纖維素，從而為土壤提供養分[26]。本研究中，硒處理下增加了根際土壤酸桿菌門（Acidobacteria）的豐度，表明土壤施硒可通過增加酸桿菌門細菌的豐度進而促進木質素和纖維素的分解，以增強油菜對養分的吸收。這與明佳佳等[17]研究結果一致。此外，有研究指出，外源條件增加土壤中酸桿菌門（Acidobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）的豐度，改變微生物種群的相互作用和平衡，從而促進作物生長，抑制土傳病害的發生[27-28]。本研究數據驗證了Liu等[18]土壤施硒降低了油菜菌核病的發病率相關研究結果。

Alpha多樣性是有效評價土壤微生物群落多樣性和物種豐富度的指標。本研究發現，土壤施硒未顯著改變油菜根際土壤樣品中細菌和真菌群落結構多樣性。有研究報道，不同硒含量土壤微生物群落結構特征明顯不同[15-16]，低濃度硒提高了土壤微生物的數量和多樣性，高濃度硒則表現出抑制效果[14]。本研究Beta多樣性分析結果表明，相比硒對土壤真菌群落的影響，硒對細菌群落的影響更為明顯。由此可見，油菜根際土壤中細菌群落對硒濃度響應表現更為敏感。

本研究中，差異物種分析結果表明，較高濃度硒（1.0 mg·kg-1）處理土壤中顯著富集產黃桿菌（Rho?danobacter）、Nitrolancea和無色桿菌屬（Achromo?bacter）。其中，產黃桿菌（Rhodanobacter）和Nitrolan?cea有助于降解土壤抗生素[29]；無色桿菌屬（Achromo?bacter）是一種對植物有益的菌屬，能夠促進植物生長，增強應激反應基因的表達量[30]。Jurado 等[31]研究表明Microbacteriaceae可以產生某些生物活性物質，可用于防控植物病害。本實驗發現Microbacteriaceae顯著富集于低濃度硒（0.5 mg·kg-1）處理土壤中，由此推測，施硒有助于特異性富集一些利于植物生長的有益微生物。

盡管硒能夠改變土壤微生物群落結構及其多樣性[13]，但不同硒含量的土壤微生物群落特征及多樣性不盡相同，這與植物類別、土壤性質、養分含量、理化性質等密切相關[16，32]。因此，后續研究有必要借助基因芯片技術，聯合土壤理化因子冗余分析，進一步深入揭示土壤養分轉化功能菌、植物生長促生菌、土傳病害病原菌等豐度及其與硒含量的關系。此外，由于數據庫物種注釋的限制，本研究暫未確定種屬的物種，未能對其在微生態環境中的功能進行解釋，有待利用其他先進手段對這些物種進行更詳細的物種注釋。

4 結論

本文在前期研究的基礎上，借助高通量測序技術分析并明確了硒對油菜根際土壤微生物群落結構與多樣性的影響。得到如下結論：

（1）硒對土壤細菌和真菌群落的多樣性無顯著影響，但影響了細菌和真菌群落中菌群的相對豐度，如增加了土壤酸桿菌門（Acidobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的豐度，但降低了放線菌門（Actinobacteria）的豐度；在真菌群落中，增加了土壤子囊菌門（Ascomycota）的相對豐度。

（2）硒對油菜根際土壤中細菌群落結構的影響顯著，對真菌群落結構無顯著影響。

（3）硒促進油菜根際土壤富集對植物生長有益的微生物。因此，本研究結果可為從根際微生態的角度解釋“硒增強植物抗性，促進植物生長”提供數據參考。