BIRC5抗體在非小細胞肺癌血漿中的表達及其與預后的關系

趙 歡 馬小莉 張 萱 韓志峰 劉元濤

(青島大學附屬青島市立醫院內分泌科，青島 266071)

細胞凋亡在清除體內衰老、惡變細胞、維持內環境穩定方面發揮關鍵作用。逃避凋亡被認為是癌癥的特征性標志之一[1]。抑制細胞凋亡在腫瘤的發生、發展、轉移中起重要作用[2]。凋亡抑制因子(bachlorival IAP repeat-containing protein 5，BIRC5)作為凋亡抑制因子基因家族成員，可通過多種機制促進細胞增殖并抑制細胞凋亡[3]。BIRC5在成熟分化的組織中微量表達或幾乎不表達，但在胚胎組織及許多惡性腫瘤中過表達[4]。腫瘤組織中過度表達的BIRC5蛋白可抑制腫瘤細胞凋亡并促進細胞增殖，使細胞的轉化突變得以保存和積累[5]。BIRC5在腫瘤組織中的過表達可激發機體免疫應答，導致BIRC5抗體產生[6]。

研究發現，在多腫瘤如乳腺癌、膀胱癌、結直腸癌、肝癌、宮頸癌患者血漿中檢測到BIRC5抗體的存在，在肺癌患者血漿中也可檢測到BIRC5抗體表達[7-12]。作為機體抗腫瘤體液免疫應答的產物，BIRC5抗體表達的意義及其對肺癌預后的影響尚不明確。與重組蛋白相比，線性抗原肽具有抗原表位特異性強、非特異性結合較少等優點，利用線性抗原肽檢測抗體更為經濟、便利，便于大規模人群篩選。因此，本研究旨在運用抗原表位預測工具設計、合成BIRC5線性抗原肽(BIRC5a、BIRC5b)并應用自行建立的ELISA檢測法，通過檢測非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer,NSCLC) 患者血漿BIRC5抗體表達水平探討BIRC5抗體表達與NSCLC預后的關系。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象與分組 選取2012年11月至2016年8月于吉林大學中日聯誼醫院胸外科首次確診、未經治療的NSCLC患者211例，均經術后病理證實為NSCLC。其中男性131例，女性80例，平均年齡58.7歲。≥60歲者106例 ，<60歲者105例，腺癌124例，鱗癌87例。根據2009年國際抗癌聯盟UICC肺癌TNM分期，將211例NSCLC患者分為：Ⅰ期 20例，Ⅱ期101例，Ⅲ期41例,Ⅳ期49例。選取同期健康志愿者200例作為正常對照組，其中男性103例，女性97例，平均年齡58.6歲。兩組年齡、性別、吸煙史無統計學差異(P>0.05)。于清晨無菌采集兩組研究對象外周靜脈血5 ml,置于枸櫞酸鈉抗凝管， 2 500 r/min離心10 min，收集上層血漿，-80℃保存待用。所有受試者知情同意，本研究經吉林大學第二醫院倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑 BIRC5抗原肽委托上海吉爾生化公司合成，96孔酶標板為美國Thermo Fisher Scientific 公司產品，過氧化物酶標記的羊抗人IgG抗體為英國Abcam公司生產，1.0 mol/L磷酸鹽緩沖液、EDTA、NaCL、Tween 20、L-鹽酸半胱氨酸、磷酸鹽緩沖片、小牛血漿白蛋白均為美國Sigma-Aldrich公司生產，顯色劑及終止液為美國Life Technologies公司產品，IgG陽性標準品為英國高地與島嶼大學尉軍教授惠贈。

1.2方法

1.2.1抗原設計、合成 利用生物信息學數據庫和抗原表位預測軟件(http://www.iedb.org)全面分析BIRC5氨基酸結構中每條肽段所處的位置及抗原性、親水性、柔性、表面可及性等特性，測試每條肽段與MHCⅡ分子結合能力及潛在的B細胞表位，設計2條線性抗原肽(BIRC5a、BIRC5b)，委托上海吉爾生化公司合成，序列見表1。

1.2.2抗原溶解與包被 用67% 冰乙酸將抗原溶解至工作濃度，即5 mg/ml。嚴格按照Thermo Fisher Scientific說明書要求包被抗原。

1.2.3ELISA法檢測BIRC5抗體 0.1%PBST溶液洗滌微孔板2次,血漿標本用0.5%BSA 稀釋100 倍后每孔加樣50 μl,室溫孵育1.5 h，洗板3 次后每孔加入用0.5% BSA 1∶50 000稀釋的過氧化物酶標記的羊抗人IgG抗體50 μl,室溫孵育1 h，洗板3次后每孔加入顯色劑50 μl，室溫避光顯色25 min，最后每孔加入終止液25 μl終止反應，在450 nm和620 nm波長下測定吸光度。每板同時設陽性對照、陰性對照,各標本均設復孔，所有樣品均測定2次，以特異性結合指數(SBR)表示血漿BIRC5抗體水平。SBR=(OD樣品-OD陰性對照)/(OD陽性對照-OD陰性對照)。

表1 BIRC5a 與BIRC5b的序列信息

2 結果

2.1NSCLC患者血漿BIRC5抗體表達與健康志愿者比較 ELISA檢測結果顯示，NSCLC患者血漿BIRC5a抗體表達水平(1.33±0.53)高于健康對照組(1.14±0.51，Z=-4.06，P<0.001)。NSCLC患者血漿BIRC5b抗體表達水平(1.03±0.57)與健康對照組(0.99±0.58)差異無統計學意義(Z=-1.19，P=0.23)。

2.2血漿BIRC5抗體在NSCLC患者中的表達與患者臨床病理特征的關系 BIRC5a抗體在不同性別、年齡、有無吸煙史、不同腫瘤大小、有無淋巴結轉移的NSCLC患者血漿中表達差異均無統計學意義(P>0.05)，而在不同分化程度、不同組織學類型NSCLC患者血漿中的表達有統計學差異(P=0.007，P=0.028,表2)。NSCLC患者血漿BIRC5b抗體表達與性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期均無關(P>0.05)。

2.3生存分析 211例患者術后均進行了規范化治療。截至最后1次隨訪(2017年12月31日)，共154例完成隨訪，其中52例死亡，隨訪率為73%，隨訪時間為1.25～63.11個月，中位隨訪時間為26.0個月。根據154例成功隨訪的NSCLC患者血漿BIRC5抗體表達水平的中位數將NSCLC患者分為BIRC5抗體高表達組和BIRC5抗體低表達組。總生存期為NSCLC患者首次診斷至死亡或最后1次隨訪時間。

2.4NSCLC患者血漿BIRC5抗體表達與患者預后的關系 Kaplan-Meier 生存分析結果顯示與血漿BIRC5b 抗體低表達組相比，高表達組NSCLC患者的生存時間顯著延長(圖1),BIRC5a 抗體高表達組與低表達組相比，患者總生存期差異無統計學意義(Log Rank檢驗，χ2=1.0,P=0.32)。單因素COX回歸分析顯示，TNM分期、淋巴結轉移、分化程度及BIRC5b 抗體水平是影響NSCLC患者總生存期的重要因素。多因素COX回歸分析結果顯示，BIRC5b抗體表達為NSCLC患者預后的獨立保護因素(HR=0.49，P=0.012，表3)。

表2 NSCLC患者血漿抗BIRC5抗體表達與臨床病理特征的關系

表3 影響NSCLC患者預后變量的單因素及多因素分析

圖1 BIRC5抗體高表達組和低表達組NSCLC患者的Kaplan-Meier 生存曲線Fig.1 Kaplan-Meier survival analysis for anti-BIRC5 IgG high expression and low expression groups in patients with NSCLCNote:A.Anti-BIRC5a IgG;B.Anti-BIRC5b IgG.

3 討論

作為凋亡抑制因子家族的成員，BIRC5可通過多種機制抑制細胞凋亡。另外，BIRC5還參與細胞周期調控[13]。因此，本研究推測BIRC5可能參與NSCLC發生發展。已有研究報道肺癌患者血漿表達BIRC5抗體，但BIRC5抗體表達的意義及其在肺癌進展中的作用鮮有報道。本研究結果顯示NSCLC患者血漿BIRC5a抗體表達較健康對照組顯著上升，且與腫瘤分化程度、組織學類型有關，而血漿BIRC5b抗體表達與健康對照組差異無統計學意義，與既往研究結論一致。由此證實，BIRC5抗體參與肺癌的發生發展。由于BIRC5a與BIRC5b為根據BIRC5蛋白結構不同抗原表位設計并合成的抗原多肽，BIRC5a與BIRC5b抗體在NSCLC患者血漿中表達水平的差異說明即使來源于同一蛋白結構，由于不同抗原表位的免疫原性不同，激發機體產生免疫應答的能力也不同。為通過預測抗原表位進一步開發更靈敏的抗體檢測方法奠定了基礎。

目前關于BIRC5的表達與NSCLC預后關系的研究結論并不一致。VISCHIONI等[14]研究發現與BIRC5表達陰性患者相比，BIRC5表達陽性的晚期NSCLC患者總生存期及無病生存期顯著延長。FALLENI等[15]認為BIRC5不能預測NSCLC患者的預后。HUANG等[16]研究結果顯示BIRC5表達與接受鉑類化療的晚期NSCLC患者的預后不良有關。本研究通過對BIRC5抗體表達水平與NSCLC患者預后的相關性分析發現，雖然BIRC5b抗體的表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期等通常提示患者預后不良的因素均無關，但血漿BIRC5b抗體高表達組較低表達組術后生存時間顯著延長。因此，推測NSCLC患者血漿過度表達的BIRC5b抗體可能抑制腫瘤發生發展。在肺癌的發展過程中，隨BIRC5基因表達上調，BIRC5蛋白分泌量逐漸增多，異常表達的BIRC5蛋白刺激機體免疫系統產生BIRC5抗體。作為機體抗腫瘤體液免疫應答的產物，BIRC5抗體的表達可能是機體免疫系統阻止肺癌進展的一種嘗試，通過抗原-抗體結合反應清除過量的BIRC5蛋白，遏制BIRC5蛋白對腫瘤細胞的促進作用。同時BIRC5b抗體的表達也為NSCLC患者的預后評估提供了潛在參考指標。

綜上，BIRC5a抗體在NSCLC患者血漿中呈高表達，但其表達與NSCLC預后無關；血漿BIRC5b抗體高表達組的NSCLC患者較BIRC5b抗體低表達組的NSCLC患者術后生存時間顯著延長，提示BIRC5b抗體表達可能在一定程度上抑制肺癌發生發展，其有望成為預測NSCLC患者預后的生物標志物。