紅景天苷抑制PI3K/Akt/mTOR通路誘導人結直腸癌細胞凋亡和自噬①

閆圣玉 謝亞鋒 劉 英 許志杰 丁雅婷 張 僑 劉菀瑩

(南華大學附屬第二醫院肛腸科,衡陽 421001)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是人類消化系統最常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害人類健康，其發病率和死亡率在世界范圍內均不斷上升[1-2]。盡管放化療的應用可以提高保肛率，但外科手術切除仍然是直腸癌主要的治療手段[3]。隨著人們對CRC認識的深入，有關其相關信號通路對腫瘤細胞發生發展的影響受到廣泛重視，為CRC的治療提供了新的思路和方法。

磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳動物雷帕霉素蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)傳導通路是一條與細胞分化、存活、增殖、血管生成、新陳代謝等密切相關的信號轉導途徑，該通道的過表達常出現在人類惡性腫瘤中，被認為是癌癥的主調節器[4]。有研究表明，PI3K 信號通路影響下游多種效應分子的活化狀態，在細胞內起抑制凋亡、促進增殖的作用，因此靶向 PI3K 途徑作為治療策略成為腫瘤研究的熱點。

紅景天為景天科紅景天屬多年生草本或亞灌木植物，具有極強的適應能力及重要的開發價值，被譽為“高原人參”。紅景天苷的化學名稱為對羥基苯乙基-β-D-葡萄糖苷，是紅景天的主要活性成分，其藥理作用多種多樣，應用前景十分廣闊，具有抗腫瘤及增強免疫的功能，其對中樞神經系統、心血管系統、肝腎、抗缺氧的作用也備受關注[5]。但目前尚未見到紅景天苷對人CRC治療的研究報道，本研究通過觀察紅景天苷對人CRCHT29細胞增殖、凋亡、自噬的影響，研究PI3K/Akt/mTOR通路的調控作用，為CRC的治療提供新的思路，具有一定價值。

1 材料與方法

1.1材料 HT29細胞購自中國科學院細胞庫；紅景天苷(北京索萊寶生命科學公司，批號：18052106)；Hoechst 33342(美國Sigma-Aldrich公司，批號L7543)；吖啶橙染色試劑盒(北京索萊寶生物技術有限公司，LY294002)；胎牛血清(Biochrom公司)；P13K(1∶500)、p-P13K(1∶250)、Akt(1∶500)、p-Akt(1∶250)、mTOR(1∶1 000)、p-mTOR(1∶500)抗體(Cell Signaling Technology)；LC3抗體(上海賽信通生物試劑有限公司)；GAPDH抗體(碧云天生物技術有限公司)；凝膠成像分析系統(Bio-Rad，型號：Chemi DocXRS+)；熒光顯微鏡(BX51，Qlympus)。

1.2方法

1.2.1HT29細胞傳代培養 HT29細胞培養于含10%牛血清、100 μg/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基，于37℃、5% CO2培養箱中常規培養，細胞融合至70%～80%時，0.25%胰酶消化傳代繼續培養。紅景天苷用細胞培養基稀釋并調節其終濃度為0.5、1.0、2.0 mmol/L。

1.2.2MTT法檢測紅景天苷對HT29細胞增殖的影響 取對數生長期HT29細胞，經0.25%胰酶消化后，調整細胞數為1×104個/ml，接種于96 孔板，100 μl/孔，置于37℃，CO2培養箱中孵育24 h。加入終濃度分別為0.5、1.0、2.0 mmol/L的紅景天苷設為紅景天苷組，并設不加藥物的空白對照組，各濃度設4個復孔。分別于培養24 h、48 h、72 h后，每孔加入 MTT溶液(0.5 mg/ml)100 μl，繼續培養4 h后棄上清，每孔加入二甲基亞砜 200 μl，振蕩10 min使藍紫色甲臜溶解，酶標儀測定550 nm波長處各孔光吸收度(OD)，計算細胞活性(以空白孔為對照，酶標儀讀取各孔OD值，OD值越高代表細胞增殖能力越強。)

1.2.3赫斯特染色檢測HT29細胞凋亡 將HT29細胞接種于24孔板，經不同濃度的紅景天苷(1.0、2.0 mmol/L)作用后，4%多聚甲醛固定，每孔加入5 mg/L Hoechst33258染色10 min，PBS清洗，封片后熒光顯微鏡下觀察。凋亡細胞指數=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.4紅景天苷對HT29細胞LC3熒光強度的影響 將HT29細胞接種于24孔板(1×105個/孔)，經不同濃度的紅景天苷(1.0、2.0 mmol/L)處理后，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定30 min。用含0.3%Triton X-100、1%牛血清白蛋白的PBS溶液封閉處理60 min，滴加LC3抗體，4℃孵育過夜。滴加FITC標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育2 h(避光)。加入適量 Hoechst33342染色10 min，封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5吖啶橙染色觀察HT29細胞內酸性囊泡細胞器的累積 細胞于6孔板中爬片培養，經不同濃度的紅景天苷(1.0、2.0 mmol/L)作用后，將吖啶橙(1 μg/ml)緩慢滴加至待測細胞，避光室溫染色5 min，吸除染液，PBS漂洗，每孔加適量4%多聚甲醛固定，封片后，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照存檔。

1.2.6Western blot檢測紅景天苷對PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達的影響 取對數生長期的 HT29 細胞，采用RIPA細胞裂解液于冰浴上提取總蛋白，BCA法定量，加入loadding buffer煮沸10 min。取等量蛋白上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗4℃孵育過夜后， TBST洗膜，加辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h，TBST 緩沖液洗滌，ECL發光顯影，凝膠成像系統拍照。

2 結果

2.1MTT檢測紅景天苷對HT29細胞增殖的影響 與對照組相比，紅景天苷(0.5、1.0、2.0 mmol/L)處理48 h、72 h后均能顯著抑制HT29細胞活力(P<0.01或P<0.001)，而紅景天苷作用24 h無明顯抑制作用(P>0.05)，見圖1。

2.2赫斯特染色檢測HT29細胞凋亡 經1.0、2.0 mmol/L 紅景天苷處理48 h后，HT29細胞染色質凝聚、固縮，凋亡形成。與對照組相比，紅景天苷組(1.0、2.0 mmol/L)凋亡細胞數明顯增加(P<0.01)，見圖2。

2.3免疫熒光染色法檢測紅景天苷誘導HT29細胞自噬 對照組HT29細胞質顯LC3綠色熒光但染色較弱，且呈彌散狀，而紅景天苷組LC3染色強度增強，見圖3。

2.4吖啶橙染色觀察紅景天苷誘導HT29細胞內酸性囊泡細胞器的累積 對照組中只有少量紅色熒光，不同濃度紅景天苷(1.0、2.0 mmol/L)作用于HT29細胞后，隨著濃度增加，被吖啶橙著色顯紅色的酸性囊泡細胞器增加。

2.5Western blot檢測紅景天苷對PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響 對照組HT29細胞中p-P13K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達較高，而各劑量紅景天苷可均抑制HT29細胞內p-P13K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達，其中1.0、2.0 mmol/L紅景天苷組p-P13K表達較對照組下降,抑制效果明顯(P<0.05)； 2.0 mmol/L紅景天苷組p-Akt表達較對照組下降(P<0.05)；0.5、1.0、2.0 mmol/L紅景天苷組p-mTOR表達較對照組均下降(P<0.01)，見圖5。

圖1 不同濃度紅景天苷對HT29細胞增殖的影響Fig.1 Effects of salidroside at different concentrations on proliferation of HT29 cellsNote:Compared with control group,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖2 赫斯特染色檢測紅景天苷對HT29細胞凋亡的影響

圖3 紅景天苷誘導自噬泡的形成Fig.3 Formation of autophagic vesicles induced by Salidroside

圖4 紅景天苷誘導HT29細胞內酸性囊泡細胞器的累積Fig.4 Accumulation of acidic vesicle organelles in HT29 cells induced by Salidroside

圖5 紅景天苷對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響Fig.5 Effect of salidroside on PI3K/AKT/mTOR signal-ing pathwayNote:Compared with control group,*.P<0.05,**.P<0.01.

3 討論

自噬即細胞的自我吞噬，是細胞內的重要降解機制，由膜包囊泡包裹部分胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質進行降解。自噬作為細胞內降解過程，對維持細胞內環境和保證細胞生存至關重要。細胞凋亡指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞主動死亡過程，腫瘤細胞的重要特征之一是由于細胞凋亡通路受阻而導致的無限增殖。研究發現，腫瘤的發生發展需要微環境的支持與保護，自噬和細胞凋亡在結腸癌的復發和轉移中起關鍵作用，PI3K/Akt/mTOR通路能調控腫瘤細胞自噬及凋亡信號傳導，使腫瘤細胞發生程序性死亡，其還可抑制腫瘤細胞增殖，對控制結腸癌發生發展產生重要影響[6-7]。

中藥紅景天的藥用價值很高，現代藥理學研究證明其具有活血化瘀、抗心肌缺血的作用，在治療婦女白帶、咳嗽、肺熱、咯血及咳血等方面療效顯著[8]。紅景天苷作為紅景天的主要有效成分之一，藥理學研究證明其具有抗氧化、免疫調節、心血管保護、抗衰老、肝臟保護、神經細胞保護及影響物質代謝等多種作用[9]。據報道，紅景天苷能抑制多種腫瘤細胞生長，如肝癌SMMC-7721細胞和QGY-7703細胞等[10]。

MTT檢測發現，紅景天苷作用24 h后對細胞無明顯抑制作用(P>0.05)，而經紅景天苷(0.5、1.0、2.0 mmol/L)作用48、72 h后與對照組相比均能顯著抑制HT29細胞活力(P<0.05)，提示紅景天苷能有效抑制人CRC HT29細胞增殖；赫斯特染色發現，經1.0、2.0 mmol/L紅景天苷處理48 h后，紅景天苷組凋亡細胞數較對照組明顯增加(P<0.05)，提示紅景天苷具有促進人CRC HT29細胞凋亡作用。

LC3是哺乳動物細胞中酵母Atg8基因的同源物，被視為自噬體形成的特殊標志，定位于自噬小體膜，參與自噬過程[11]。自噬發生時，LC3由Ⅰ型轉化為Ⅱ型，且LC3表達上調。免疫熒光染色發現，紅景天苷組HT29細胞中LC3綠色熒光染色強度較對照組增加，提示紅景天苷治療可促進LC3自噬泡的形成；吖啶橙染色發現，隨著紅景天苷濃度增加，吖啶橙著色的酸性囊泡細胞器紅色增強，而對照組僅顯弱紅色，提示紅景天苷能促進細胞自噬，與LC3免疫熒光染色結果基本一致，可能與其抗腫瘤作用相關。

PI3K/Akt/mTOR通路是一條經典的抑自噬、促存活的信號轉導通路，在惡性腫瘤的發生、發展、治療及轉歸中發揮重要作用[12]。細胞內活化的 PI3K是一種廣泛存在于胞質內的磷脂酰肌醇激酶，能促進PIP2轉化為PIP3，激活下游信號分子Akt，進而激活其下游的mTOR，磷酸化的mTOR能通過清除泛素蛋白抑制自噬發生，還能使細胞周期素上調而加速細胞周期[13]；PI3K/Akt/ mTOR還是與細胞凋亡關系最密切的信號傳導通路之一，能通過抑制各種癌細胞的凋亡促進細胞生長[14-15]。Akt是一種抗凋亡信號分子，其在PI3K調控下激活，經多種途徑調控細胞凋亡[16-17]。因此，通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制Akt活性可激活細胞凋亡。Western blot結果顯示，不同濃度紅景天苷均可顯著抑制p-P13K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(P<0.05)。提示紅景天苷可抑制PI3K/Akt/mTOR通路活化，激活TH29細胞自噬反應，同時提高自噬流導致自噬反應過度，進一步促進HT29細胞凋亡，最終導致腫瘤細胞損傷，抑制腫瘤。

綜上所述，細胞自噬和凋亡在CRC的發生發展中發揮重要作用，紅景天苷通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，一方面誘導人CRC細胞HT29凋亡，另一方面促進其發生自噬性死亡從而發揮抗腫瘤作用。因此，課題組將進一步探究紅景天苷對CRC細胞的抑制效應，以期為臨床治療提供支持。