養(yǎng)正合劑和粒細(xì)胞集落刺激因子對化療后骨髓功能的影響①

寇小妮 朱 江

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肝病二科，咸陽 712000)

化療始終是現(xiàn)階段及將來很長一段時間內(nèi)治療惡性腫瘤的重要手段，對于控制病灶、緩解癥狀及延長生存期均有重要作用。然而，化療藥物在治療多種腫瘤時常常伴有骨髓抑制、惡心嘔吐、疲勞、腹瀉、脫發(fā)等副作用，如廣譜抗腫瘤藥環(huán)磷酰胺(Cytoxan，CTX)屬于細(xì)胞周期非特異性化療藥物，對增殖周期中各期細(xì)胞的殺滅作用突出，對粒細(xì)胞的影響更為明顯，其典型毒副作用即為骨髓抑制(白細(xì)胞下降等)[1-2]。如何消除或減輕CTX等化療藥物所帶來的毒副反應(yīng)已成為臨床上亟待攻克的難題。事實上，大部分骨髓抑制需藥物治療，臨床上常給予集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)，但CSF致白血病的觀點已得到證實，且其本身可引起多種不良反應(yīng)，加之價格較高限制了其應(yīng)用[3-4]；與此同時，祖國醫(yī)藥在減輕骨髓抑制等化療毒副反應(yīng)方面有獨到優(yōu)勢[5]，近年來臨床對中藥配方制劑及單體成分作用的關(guān)注有增無減。現(xiàn)設(shè)計隨機對照動物實驗，以CTX致骨髓功能抑制小鼠模型，觀察養(yǎng)正合劑和rhG-CSF對化療后骨髓功能的影響，并研究其可能機制，以期為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康雌性C57BL/6小鼠共50只，雌雄各半，購自本市醫(yī)科學(xué)院實驗動物中心，6～8周齡，體重18～22 g。實驗小鼠均飼養(yǎng)于12 h光明/12 h黑暗、20～26℃(溫差不低于3℃)、濕度40%～70%且無特定病原體污染級別環(huán)境中，自由攝食與飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實驗。小鼠均予以編號，建模后以隨機數(shù)字表法分為5組：空白組、模型組、rhG-CSF組、養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)正合劑2組，各10只。本研究獲動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2主要藥品與儀器 注射用CTX購自上海華聯(lián)制藥有限公司；中藥配方制劑養(yǎng)正合劑購自陜西步長制藥有限公司(國藥準(zhǔn)字Z10970042)；重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，rhG-CSF)購自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司(國藥準(zhǔn)字S19980010)；血清可溶性L-選擇素(sL-selectin,sCD62L)、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)ELISA試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司；免疫組化檢測試劑盒購自丹麥DAKO公司；高速冷凍離心機購自湖南湘儀離心機儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡購自日本Nikon公司；全自動血細(xì)胞分析儀購自日本SYSMEX公司。

1.2方法

1.2.1動物模型制備 參照文獻(xiàn)[6]改良方法，以ip CTX方法制備骨髓功能抑制小鼠模型。模型組、rhG-CSF組、養(yǎng)正合劑組小鼠給予CTX生理鹽水溶液40 mg/kg腹腔注射，1次/d，連續(xù)3 d，空白組腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2給藥 空白組、模型組、rhG-CSF組、養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)正合劑2組于建模后(實驗第4天)分別給予生理鹽水(0.2 ml)、生理鹽水(0.2 ml)、rhG-CSF(30 μg/kg)、養(yǎng)正合劑(4 mg/kg)及養(yǎng)正合劑(8 mg/kg)腹腔注射，1次/d，連續(xù)10 d(實驗第4～14天)。每日密切觀察小鼠生存狀態(tài)，各組動物在第14天處死并完成各項檢測。

1.2.3檢測指標(biāo) ①將實驗開始(化療)前檢測的指標(biāo)作為基線水平，即d 0；分別于注射前及注射開始后第3、5、7、10、14天在眼底靜脈叢采血50 μl，3 000 r/min 離心處理(離心半徑15 cm)10 min后取血清標(biāo)本，以ELISA法測定血清sCD62L、GM-CSF水平；并在離心處理前通過肝素抗凝后以全自動血液細(xì)胞分析儀測定外周血白細(xì)胞(white blood cell，WBC)、紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)、血紅蛋白(hemoglobin，HGB)、中性粒細(xì)胞絕對數(shù)(absolute neutrophil number，ANC)及血小板(platelet，PLT)含量，繼而明確各組外周血象下降與恢復(fù)情況。②脾指數(shù)測算，于末次給藥后24 h處死小鼠取脾臟，除去表面結(jié)締組織并用濾紙吸干表面血液，迅速稱質(zhì)量，并計算脾臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值，即為脾指數(shù)。③骨髓形態(tài)學(xué)分析，各組小鼠處死后取骨髓組織，切片后進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察，并以圖像分析軟件測定骨髓腔面積中骨髓造血組織面積占比。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠血清sCD62L、GM-CSF及外周血象變化比較 ①模型組、rhG-CSF組、養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)合劑2組CTX注射后第7天， 血清sCD62L、GM-CSF水平及外周血WBC、RBC、HGB、ANC、PLT明顯降低， 與同組d0時相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。②rhG-CSF組血清GM-CSF及外周血象各項指標(biāo)在第10天、14天逐漸達(dá)到空白組水平，但血清sCD62L水平始終處于較高水平；養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)正合劑2組血清sCD62L水平在第10天、14天恢復(fù)至空白組水平，外周血象各項指標(biāo)逐漸接近空白組水平。③第14天，血清sCD62L水平比較，rhG-CSF組>模型組>養(yǎng)正合劑1組>養(yǎng)正合劑2組；血清GM-CSF及外周血RBC、HGB、ANC、PLT比較，模型組<養(yǎng)正合劑1組<養(yǎng)正合劑2組

2.2各組小鼠脾指數(shù)及骨髓形態(tài)學(xué)分析結(jié)果比較 末次給藥后24 h， rhG-CSF組、養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)正合劑2組脾指數(shù)均顯著低于模型組，骨髓腔面積中骨髓造血組織面積占比顯著高于模型組(P<0.05)；其中rhG-CSF組脾指數(shù)、骨髓腔面積中骨髓造血組織面積占比與空白組接近(P>0.05)，養(yǎng)正合劑2組脾指數(shù)明顯低于養(yǎng)正合劑1組，骨髓腔面積中骨髓造血組織面積占比明顯高于養(yǎng)正合劑1組(P<0.05)；但養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)正合劑2組與rhG-CSF組、空白組相比差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表1。

圖1 各組小鼠血清sCD62L、GM-CSF及外周血象變化Fig.1 Changes of serum sCD62L, GM-CSF and peripheral hemogram in mice of each groupNote:A.Serum sCD62L;B.Serum GM-CSF;C.Peripheral blood WBC;D.Peripheral blood RBC;E.Peripheral blood HGB;F.Peripheral blood ANC;G.Peripheral blood PLT.

圖2 各組小鼠骨髓形態(tài)學(xué)表現(xiàn)示例(HE染色，×400)Fig.2 Example of bone marrow morphology of mice in each group (HE staining,×400)Note:A.Blank group mice;B.Model group mice;C.rhG-CSF group mice;D.YangZheng compound mixture group 1 mice;E.YangZheng compound mixture group 2 mice.

表1 各組小鼠脾指數(shù)及骨髓形態(tài)學(xué)分析結(jié)果比較

3 討論

骨髓抑制是化療后嚴(yán)重且常見毒副反應(yīng)之一，也是血液系統(tǒng)常見的、 可危及生命的毒性反應(yīng)， 外周血中WBC為主的全血細(xì)胞下降為主要特征，WBC下降也是最常見、最早出現(xiàn)的異常情況，其次為PLT、RBC、HGB、ANC減少或下降，故骨髓抑制往往伴貧血、出血、抗感染能力下降等嚴(yán)重不良反應(yīng)，可較大程度影響腫瘤治療與預(yù)后[7-8]。對于化療藥物引起骨髓抑制的主要機制，當(dāng)前文獻(xiàn)大多支持的觀點是藥物對造血干細(xì)胞的損傷，同時損傷骨髓基質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能[9]。為改善或避免化療藥物對骨髓功能的損害，長久以來臨床進(jìn)行了大量實驗和研究，已證實CSF對于促進(jìn)骨髓內(nèi)造血細(xì)胞增殖并進(jìn)入外周血有顯著作用，可明顯減輕或緩解化療后的骨髓功能抑制，但也有報道指出CSF長期大量應(yīng)用是增加白血病發(fā)病的危險因素，且其能刺激某些腫瘤細(xì)胞生長[10-11]；另有研究發(fā)現(xiàn)部分腫瘤患者化療后骨髓造血細(xì)胞增殖本身即為活躍而非抑制狀態(tài)，加之CSF價格較高，注射方式繁雜，也可引發(fā)不良反應(yīng)(發(fā)熱、骨骼酸痛等)，故臨床對CSF使用存在一定質(zhì)疑[12]。對于骨髓功能抑制，臨床實際中常予以針對性治療，較少預(yù)防，急需新藥研發(fā)。

中醫(yī)藥在治療骨髓抑制方面已被證實有一定療效，現(xiàn)代藥理學(xué)表明其機制主要包括促進(jìn)造血祖細(xì)胞分化與增殖，激活造血生長因子、造血祖細(xì)胞因子表達(dá)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖及增強NK細(xì)胞活性等[13-14]。從中醫(yī)學(xué)角度看，骨髓抑制歸屬于“虛勞-血虛”范疇，認(rèn)為血的生成與脾緊密相關(guān)，即血液化生過程起初通過外界攝取食物，后經(jīng)脾胃運化為生成血液的物質(zhì)基礎(chǔ)，而后化生為氣血，故而脾胃化源是否充足直接影響氣血充盈程度。有學(xué)者指出，對于化療藥物引起的氣血虧虛，健脾益氣法治療能夠培補脾胃之本，增強氣血生化之源[15]。養(yǎng)正合劑主要由紅參、黃芪、枸杞、女貞子、豬苓、茯苓6味中藥制成，具有益氣健脾、滋肝養(yǎng)腎的作用，早期研究已證實其能增強人體免疫力，用于治療腫瘤患者化療后引起的氣陰兩虛及緩解神疲乏力、少氣懶言、五心煩熱、口干咽燥等癥狀有顯著效果[16-17]。

本研究中，除空白組外，各組CTX注射后第7天血清sCD62L明顯升高，GM-CSF及外周血WBC、RBC、HGB、ANC、PLT降低，表明CTX可致骨髓功能抑制，且骨髓抑制狀態(tài)下血清sCD62L表達(dá)升高，GM-CSF表達(dá)降低。為了進(jìn)一步明確養(yǎng)正合劑改善骨髓功能抑制的作用，本實驗以rhG-CSF干預(yù)為對照，對養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)正合劑2組小鼠給予小劑量、大劑量養(yǎng)正合劑干預(yù)，發(fā)現(xiàn)rhG-CSF組血清GM-CSF及外周血象各項指標(biāo)在第10天、14天逐漸達(dá)到空白組水平，但血清sCD62L水平始終處于較高水平，進(jìn)一步證實rhG-CSF促進(jìn)粒細(xì)胞集落刺激因子產(chǎn)生，繼而促進(jìn)GM-CSF表達(dá)，改善外周血象；而養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)正合劑2組血清sCD62L水平在第10天、14天恢復(fù)至空白組水平，外周血象各項指標(biāo)逐漸接近空白組水平，提示養(yǎng)正合劑可降低化療后骨髓抑制狀態(tài)小鼠血清sCD62L表達(dá)、改善外周血象。事實上，早期有研究指出骨髓抑制的重要原因之一在于骨髓內(nèi)成熟造血細(xì)胞釋放功能障礙，證實CD62L參與了粒細(xì)胞釋放過程，即低表達(dá)CD62L的細(xì)胞易于進(jìn)入外周血，反之，高表達(dá)CD62L的細(xì)胞則會粘附在血竇內(nèi)皮細(xì)胞上阻礙其釋放[18]。因此推測養(yǎng)正合劑可降低骨髓粒細(xì)胞CD62L表達(dá)，保護(hù)骨髓粒細(xì)胞系統(tǒng)從而調(diào)節(jié)骨髓粒細(xì)胞釋放功能障礙，促進(jìn)骨髓粒細(xì)胞釋放入血，達(dá)到促進(jìn)血細(xì)胞進(jìn)入外周血液而恢復(fù)外周血象的目的，但確切機制有待進(jìn)一步闡明。需指出的是，第14天，血清sCD62L水平rhG-CSF組>模型組>養(yǎng)正合劑1組>養(yǎng)正合劑2組，GM-CSF及RBC、HGB、ANC、PLT水平模型組<養(yǎng)正合劑1組<養(yǎng)正合劑2組

作為主要的外周免疫器官，脾臟是T、B細(xì)胞接受血源性刺激分化成熟并產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞與漿細(xì)胞的主要部位，其功能狀態(tài)直接決定了機體能否發(fā)揮正常的免疫功能，脾指數(shù)在一定程度上直接體現(xiàn)機體免疫功能狀態(tài)，也被眾多研究作為評估骨髓功能的實驗指標(biāo)[19-20]。本實驗?zāi)┐谓o藥后24 h，rhG-CSF組、養(yǎng)正合劑1組、養(yǎng)正合劑2組脾指數(shù)均低于模型組，骨髓腔面積中骨髓造血組織面積占比高于模型組，提示rhG-CSF、養(yǎng)正合劑均可有效降低脾指數(shù)，增強小鼠免疫功能及骨髓造血功能。近期研究證實紅參、黃芪配伍能促進(jìn)造血、增強免疫功能[21]。本實驗養(yǎng)正合劑2組小鼠脾指數(shù)、骨髓腔面積中骨髓造血組織面積占比改善效果優(yōu)于養(yǎng)正合劑1組，但與rhG-CSF組、空白組相比仍有明顯差異，表明大劑量養(yǎng)正合劑增強免疫功能、提升骨髓造血功能的效果優(yōu)于小劑量，雖然二者的改善作用不如rhG-CSF強烈，但養(yǎng)正合劑促進(jìn)粒細(xì)胞集落刺激因子產(chǎn)生的作用可能更緩和、持久，可能與兩種藥物作用機制、藥效時間差異有關(guān)。陳凌波等[22]實驗顯示黃芪當(dāng)歸配伍可通過促進(jìn)骨髓粒細(xì)胞釋放來提高外周血象指標(biāo)，作用緩和而持久，而rhG-CSF主要機制為促進(jìn)骨髓粒細(xì)胞增殖，作用強烈，或可解釋為何本實驗養(yǎng)正合劑的改善作用不如rhG-CSF顯著，但其具體原因仍需進(jìn)一步探究。