新型冠狀病毒性肺炎患者樣本實驗室預處理和安全防護策略的探討

顧芯瑕， 曹 婷， 姜淮蕪， 蔣 歐， 張 標， 劉 杰

（1.四川大學華西臨床醫學院華西醫院感染與疫苗研究室，成都610041；2.綿陽四0四醫院，四川綿陽621000；3.內江市第二人民醫院，四川內江641100；4.德陽市人民醫院，四川德陽618000）

0 引 言

自2019年12月以來，新型冠狀病毒性肺炎（COVID-19）迅速從湖北武漢蔓延至全國，各地先后啟動了突發公共衛生事件一級應急響應措施［1］。直至2020年4月，確診和疑似病例開始逐漸下降，各地的應急響應等級相應下調。但疫情仍在繼續，特別是境外輸入導致的疫情風險不容樂觀［2］。作為實驗醫學和科研人員在這次疫情中承擔了繁重的疾病診斷和科技攻關等任務。因新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的傳播途徑廣、傳染性強且在當時尚無有效的預防性疫苗和治療手段，在2020年1月23日國衛辦科教函〔2020〕70號發文《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》（第2版）中將該病原體暫按照病原微生物危害程度分類中第2類病原微生物進行管理［3-4］。未經培養的感染性樣本的處理（滅活前的病原學檢測、血清學檢測、核酸提取、生化分析等），應當在生物安全2級實驗室進行，同時采用生物安全3級防護。滅活樣本的處理應當在生物安全2級實驗室進行。分子克隆等不含致病性病原的處理，可在生物安全1級實驗室進行。按照這一要求在實驗室開展了COVID-19患者樣本的處理，為臨床診斷和科學研究提供了有力的支撐。通過這一次實踐，操作人員增強了對生物安全的認識，積累了操作經驗。并希望分享這些經驗，進一步提高實驗科學的水平。

1 生物安全防護要求

流行病學資料提示SARS-CoV-2的傳播以空氣/氣溶膠為主，不排除體液和排泄物也是傳播媒介［5-6］。這種多媒介的傳播特征給患者樣本的處理帶來較大的生物安全風險，給防護提出了更高的要求。樣本處理過程中遵循的安全規范包括使用符合要求的實驗空間和設備，選擇合理的個人防護裝備，遵守個人防護裝備的穿脫流程，以及對實驗空間和設備的清潔等都是維護生物安全，保障操作人員健康的重要手段，也是避免環境污染的必要措施。

1.1 實驗室空間和設備的要求

符合生物安全要求的實驗空間是開展COVID-19患者樣本處理的基本前提。根據國家衛生健康委員會辦公廳《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》（第2版）要求，COVID-19患者樣本在未滅活前應在生物安全2級實驗室（Biosafety Level-2，BSL-2）和生物安全3級個人防護的條件下處理。BSL-2分為常壓和負壓兩種類型。因SARS-CoV-2主要經空氣傳播，建議在具備負壓條件的加強型BSL-2中開展COVID-19樣本的處理。加強型BSL-2通過負壓梯度差實現空氣定向從清潔區流向輕度污染區、重度污染區，最后經過濾后排出。空氣的定向流動能防止有害因子無序或逆向擴散和防止環境污染［7-8］。樣本處理間應配備霧化或紫外消毒設施，以便對空間和物體表面進行消毒。根據中華人民共和國衛生部《消毒技術規范》（2002年版）［9］紫外燈功率要求平均每m3不低于1.5 W。樣本處理間的物品擺放應避免遮擋需消毒處理的表面和減少照射的死角。紫外燈的輻照強度至少每月檢測1次。檢測方法為開啟紫外線燈5 min后，用照度計在燈管下方垂直距離1 m的中心處測量其輻照度值（μW/cm2），有效輻照度值應≥70μW/cm2。根據《消毒技術規范》（2002年版）滅活病毒的照射劑量為0.1 W·s/cm2，需照射的時間是：0.1 W·s/cm2÷70×10－6W/cm2＝1 429 s÷60 s≌24 min，所以結束實驗后樣本處理間和生物安全柜至少進行1 h的有效紫外照射。選擇符合要求的實驗空間和使用有效的清潔措施是從物理防護和化學消殺兩方面確保生物安全的基本要求。

開展COVID-19患者樣本處理的設備也應滿足相應的生物安全要求。樣本組織的操作均應在Ⅱ級A2型生物安全柜中進行。生物安全柜分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ防護等級［10］。Ⅰ級生物安全柜不保護樣本可保護工作人員和外界環境，在排氣口設置了高效過濾器。Ⅱ級生物安全柜依照進氣、排氣和循環方式等可分為4個型號，分別為A1，A2，B1和B2型。其中以A2型（30%外排，70%內循環）和B2型（100%外排）為主。Ⅱ級生物安全柜的型號選擇不以生物因素決定，而是視操作是否有毒化品或放射性物質。涉及毒化品或放射性物質需選擇B2型，低致病性生物樣本選擇A2型。Ⅲ級生物安全柜是為生物安全3、4級實驗室（BSL-3或BSL-4）設計。柜體完全氣密，工作人員通過連接在柜體的手套進行操作（俗稱手套箱），適用于高致病性微生物。Ⅱ級A2型生物安全柜工作區域（污染部分）始終處于負壓狀態，前窗的垂直下降氣流維持與外環境的隔離。操作過程中形成的氣溶膠或者污染氣體經負壓通道傳輸到風道，再通過超高效空氣粒子過濾（HEPA過濾，對＞0.3μm的微粒過濾效率≥99.99%）排出，避免操作人員和環境暴露于污染氣溶膠。建議在離心操作時選用吊桶配備密封蓋的離心機，防止離心機高速運轉過程中腔體內形成污染性氣溶膠，也避免試管意外破損后樣本泄露造成離心機甚至整個實驗空間的污染。離心結束后至少靜置5 min再開蓋［8］，開蓋后可用75%乙醇噴灑離心機腔體以減少氣溶膠污染的風險。樣本滅活可以選用熱空氣法或水浴法。恒溫孵育箱或水浴鍋應置于樣本處理間內，且提前加熱到56℃。根據國家衛生健康委員會辦公廳發布的《新型冠狀病毒性肺炎診療方案》（試行第7版）［5］，SARS-CoV-2對熱敏感，在56℃30 min的條件下即可滅活。熱空氣滅活法應注意保持樣本間距。水浴滅活法水的液面應不低于樣本液面，使樣本均勻受熱以達到有效滅活。不論空氣或水浴滅活均應設置參考溫度計，以確保樣品中心部分達到要求的滅活溫度和時間。因此，不僅儀器設備的技術參數要滿足生物安全要求，同時正確使用和質量控制也是保障生物安全和樣本質量的必要條件。

表面化學消毒劑也是保障生物安全的必備用品。其選擇決定于有效性和消殺表面的耐受/接受性。我們建議在樣本處理前準備足量的有效消毒液。按照國家衛生健康委辦公廳《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》（第2版）［3］的要求，如發生操作失誤或意外造成的污染，用到的消毒劑包括有效氯含量為0.55%的消毒液（5 000 mg/L）、2 g/m3的過氧乙酸、8 g/m3的高錳酸鉀－10 mL/m3甲醇（40%）混合液。除此之外，對轉運箱、包裝袋和樣本采集管表面處理需使用75%的乙醇。穿脫個人防護用品過程中需速干手消毒液或75%的乙醇。其中，過氧乙酸和含氯消毒劑包括漂白粉、次氯酸鈉、次氯酸鈣（漂粉精）、二氯異氰尿酸鈉（優氯凈）、三氯異氰尿酸等屬于高效消毒劑；醇類及其復配消毒劑等屬于中效消毒劑；市面上速干手消毒液，包括醋酸氯己定、葡萄糖酸氯己定等雙胍類消毒劑等，屬于低效消毒劑［9］。氯己定已不能用于SARS

Cov-2的消毒處理［5］。化學消毒劑的選擇應嚴格參照要求和認真閱讀說明。

1.2 個人防護要求及注意事項

針對SARS-CoV-2多種傳播途徑的特點，操作者的個人3級防護是處理非滅活樣本的基本要求。除常規的一次性帽子、手套、鞋套、連體防護服外，重點避免呼吸道和眼部黏膜的暴露，配備醫用防護口罩防止氣溶膠的吸入，佩戴護目鏡防止氣溶膠接觸或樣本飛濺入眼部。但應注意區分安全鏡和安全護目鏡。安全鏡與面部不貼合，難以達到保護效果。而安全護目鏡與面部貼合，能有效阻止感染性氣溶膠和液體飛濺入眼部。建議穿戴防護用品在實驗室清潔區完成。其順序為：更換手術洗手衣、實驗室用鞋→醫用防護口罩→雙層防護帽→雙層鞋套→連體防護服→靴套→護目鏡→一次性防水隔離服（可選）→雙層乳膠手套。在連體防護服外增加一次性防水隔離服，能避免液體浸染連體防護服，也便于沾染后的消毒和更換，避免操作者返回緩沖區更換。褪脫防護用品應遵循先外后里的順序。實驗結束后用75%酒精噴灑胸前、手腕（特別是手套和防護服袖口結合部位、防護服領口部位）。最外層的手套和一次性防水隔離服應在污染區脫掉，更換新的手套再進入緩沖區。脫摘流程依次為：75%酒精噴灑胸前、手腕、手套→摘護目鏡→脫靴套→脫連體防護服→摘第一層手套→摘口罩和防護帽→脫鞋套→摘第二層手套→洗手或手消毒。一次性隔離服和連體防護衣脫離時均應把向外的污染面卷向里面，將其折疊或卷成包裹狀，且褪脫和折卷動作要輕緩，避免表面附著的污染物因劇烈抖動造成空氣污染，避免防護服污染面接觸內層衣物。防護裝備褪脫前對胸前、手腕、手套進行75%酒精噴灑可以降低褪脫過程中發生接觸污染的風險。應將穿脫程序用文字和圖示張貼在更衣區，提示實驗人員按正確的步驟有序進行，且由兩人相互協助，并相互檢查確保正確穿戴和褪脫。

強調戴口罩前洗手或手消毒，在佩戴過程中避免手接觸到口罩內側，降低污染的風險。根據自己的臉型調整好口罩的位置后，應用兩手的食指沿著口罩的上緣按壓鼻夾，使其與面部緊貼。戴上口罩后，用力呼氣，空氣不能從口罩邊緣漏出。男性必須刮凈胡須，確保口罩能夠與臉部的密合良好。在醫用防護口罩臨時得不到充足供應的疫情早期，采用在N95/KN95口罩外層增加醫用外科口罩，以達到醫用防護口罩的防護效果。通用N95和KN95口罩的區別在于N95是執行美國聯邦法規CFR 42-84-1995《NIOSH Guide to the Selection and Use of Particulate Respirators》（NIOSH顆粒物防護口罩的選擇和使用指南）的標準。N（Not resistant to oil）代表不耐油，能阻隔的污染物類型是固體和水基微粒，測試時使用氯化鈉；KN95執行的是中國GB 2626-2006《呼吸防護用品自吸過濾式防顆粒物呼吸器》標準，過濾非油性顆粒物KN類［11-12］。通用N95和KN95口罩是防塵設計，不防液體噴濺。而醫用防護口罩執行中國GB 19083-2010/歐洲EN 14683-2019《醫用口罩要求和試驗方法》等相應的標準［13-14］，不僅過濾空氣中的顆粒物，還能阻隔飛沫，對血液、體液、分泌物等有防噴濺的功能。醫用外科口罩（中國行業標準YY 0469-2011《醫用外科口罩》）的細菌過濾效率≥95%，對非油性顆粒的過濾效率僅要求≥30%，另外對血液的穿透能力、承受的壓力差等也有相應的要求［15］。在特殊時期結合實際供應情況，按照防護要求，合理選擇和正確使用口罩，采用N95或KN95口罩和醫用外科口罩的搭配，加強了N95或KN95口罩防噴濺效果，確保操作者呼吸道的安全。

手是高風險部位。因此要求雙層乳膠手套的防護，并在使用前常規檢查氣密性。手套腕部應遮蓋防護服袖口，減少皮膚的暴露。操作過程中，若外層手套被污染應立即噴灑消毒后脫去，棄于生物安全柜內的垃圾容器中，并更換上新的外層手套。禁止在實驗過程中手套接觸面部和面部防護用品，避免觸摸不必要的物體表面，如燈開關、門把手等。在個人摘脫防護用品前，應先更換新手套。保護好手部的安全和禁止與面部等清潔部位的接觸是減少病原體污染的關鍵。

2 樣本收集所需耗材及使用

（1）COVID-19患者血液樣本的收集。根據需求選擇相應的采血管，收集血清常用紅頭或黃頭管，收集血漿和血細胞常用紫頭或綠頭管。紅頭管不含添加劑，采集的血清用于常規生化分析；黃頭管含促凝劑和惰性分離膠更便于血清的分離，離心后血塊和血清被惰性分離膠隔離，便于直接上機檢測和標本的保存，而對電解質、酶類等敏感指標的穩定性影響小。建議對血清采集管離心5～10 min處理后再轉運，以避免溶血和保證樣本質量。紫頭管內含有乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）以及其鹽，能有效地螯合血液中的鈣離子，阻止和終止內源性或外源性凝血過程。EDTA對血球的凝集及血細胞的形態影響較小，而綠頭管內添加有肝素，過量肝素會引起白細胞聚集，不能用于白細胞計數和分類。若有其他特殊需求，可選擇相應類型的采血管。

（2）咽拭子采樣管含Hank’s保存液。若開展病毒分離，可選擇性添加抗生素、抗真菌劑、牛血清白蛋白（BSA）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES）、氨基酸、甘油等。BSA、HEPES等可在較寬的溫度范圍內穩定細胞活性，減少核酸的降解和病毒活性喪失，以保障病毒分離的成功率。咽拭子樣本收集后裝入雙層密封袋中，置于感染性樣本低溫轉運箱中轉送。樣本應于24 h內完成預處理和轉至超低溫保存，以保證檢測結果的可靠性。

（3）尿液應轉移至密閉容器中轉運。一次性尿杯密閉性差，在轉運交接過程中容易發生泄漏和樣本間交叉污染，不僅影響檢測的準確度，且增加樣本轉運和處理過程中的安全風險。建議尿液在院內收集后轉移到帶有螺旋蓋的密閉無菌容器（如50 mL的離心管）內轉運。且每例病人的尿液樣本用密封袋單獨包裝。

（4）大便收集于無菌采集器中應盡快處理或送檢。由于大便中含有大量的消化酶，應叮囑患者收集新鮮的大便，采用低溫保存和1 h內送樣，保證大便中病毒核酸的完整性。

3 樣本處理風險及應對建議

為縮短在3級防護條件下的操作時間，減少因心里和工作壓力帶來的標記失誤，在收到采樣信息后，實驗室工作人員可提前根據樣本信息準備標簽，預先準備和標記樣本處理、分裝和保存所需的容器。我們選擇防酒精的記號筆標記凍存管，避免常規標簽紙在液氮中脫落和普通記號筆標記遇酒精噴灑洗脫。安排至少2人在樣本處理間和3級防護環境下相互配合處理樣本，另外1人在樣本處理區外協助，傳遞必要的試劑、耗材和提供其他輔助，以免穿著3級防護服的操作人員反復進出操作間，造成安全隱患和防護物資的浪費，也節省了多次穿脫防護服的時間。減少在3級防護條件下的工作時間，減少人員的穿梭能提高樣本處理過程的安全性。

樣本在滅活過程中確保均勻受熱以達到有效滅活，應注意水浴鍋中水的液面高度不能低于樣本液面的高度，尤其是體積量較大的尿液樣本。血液樣本的預處理過程中，不建議滅活后分離血清或血漿。紅細胞受熱和震蕩易誘發溶血，有核細胞因細胞膜受損也會釋放胞漿內容物，影響檢測的準確性。咽拭子樣本滅活后在生物安全柜內開蓋，將管內的咽拭棉簽在管壁上輕柔擠壓后棄去，避免用力過度將棉簽折斷，發生感染性液體飛濺。

4 廢棄物的處理和操作間消毒

首先要確保廢棄物無遺漏和泄漏。為保證垃圾袋的完整性，防止尖銳物品如吸頭或移液管等戳破垃圾袋，至少使用2層生物醫療專用垃圾袋，且垃圾量不超過垃圾袋容量的2/3。收集過程中無擠壓。直接接觸患者樣本的固體廢棄物應置于生物安全柜中的垃圾桶中，實驗結束后雙層垃圾袋分層密封，表面經75%乙醇處理后轉移出生物安全柜。感染性液體廢棄物，如尿液樣本、細胞洗滌液、培養基等倒入安全柜內的最終有效氯含量為0.55%的廢液缸中，實驗結束后在生物安全柜內加蓋，表面經75%乙醇消毒后，并置于雙層醫療廢物垃圾袋密封后移出生物安全柜。所有垃圾需經121℃，30 min高壓滅菌。并建議滅菌處理設置為非排氣模式，避免滅菌設備在排氣過程中造成意外的環境污染。滅菌處理后的垃圾置于醫療廢物暫存點保管和登記，交具備資質的生物醫療垃圾處理公司處理［16］。

實驗結束后，需對生物安全柜等不銹鋼臺面采用噴灑75%乙醇后用紙巾擦拭的方式清潔；對于操作間地面和實驗桌臺面采用噴灑有效氯為0.55%的消毒液清潔。然后對生物安全柜和整個操作間進行紫外消毒≥1 h。

5 應急處理

整個樣本處理操作過程中應認真、仔細、沉穩，避免操作失誤帶來的安全隱患。《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》（第2版）中建議的應急消毒法有0.55%有效氯消毒液（排除氯己定）、2 g/m3過氧乙酸熏蒸過夜或20 g/L的過氧乙酸用氣溶膠噴霧器進行8 mL/m3的劑量進行噴灑1～2 h，必要時使用高錳酸鉀（8 mL/m3）—甲醛（10 mL/m3）混合液熏蒸4 h以上。但對于過氧乙酸和高錳酸鉀都屬易制爆管控物，采購的審批手續復雜且耗時，對存放和管理要求高，建議在非特殊情況下使用高效消毒劑次氯酸鈉，如84消毒。這類消毒劑應用范圍廣、購置方便和容易保存。但應在配制后24 h內使用才能保證消毒效果。若在生物安全柜內發生泄漏造成局部污染，使用現配的有效氯含量0.55%的消毒液噴灑處理，并及時擦拭干凈，減少對不銹鋼的腐蝕。

6 結 語

本次COVID-19的爆發是繼2003年的SARS疫情后再一次對公共衛生系統生物安全防控體系的考驗，對臨床醫療和科研應急能力的挑戰。在這一次考驗和挑戰中檢驗了生物安全實驗平臺的建設成效，鍛煉了平臺的管理隊伍，培養了具備生物安全知識的后備力量。還需在工作中進一步總結經驗，對存在的不足進行改進和完善，逐步健全實驗平臺的生物安全防控體系，為基礎研究和臨床實踐提供有力的技術支撐。