肝細胞癌患者肝動脈化療栓塞術后外周血長鏈非編碼RNA TINCR水平與Th1/Th2平衡及預后的相關性分析

柏 濤，王靜麗，胡旭東，夏 冰，程海林，王 娟

武漢市金銀潭醫院 a.消化科，b.肝病科，c.感染科，武漢 430023

由于肝細胞癌(HCC)缺少特異性的早期癥狀，患者臨床確診時大多處于中晚期，無法進行根治性手術，患者5年生存率不足5%[1]。近年來，隨著現代影像設備的不斷發展以及微創技術水平的不斷提高，在大型設備數字減影機的應用下，對于無法進行手術根治的HCC患者行肝動脈化療栓塞術(TACE)成為主要治療方式[2]。TACE介入治療可有效減少、阻斷腫瘤血供，從而導致腫瘤缺血、缺氧而壞死[3]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類缺乏開放閱讀框、長度>200個核苷酸的非編碼RNA。近年研究[4]顯示，lncRNA參與了機體各種生理以及病理過程，同時在腫瘤細胞增殖、遷移等過程中作為抑癌基因或致癌基因發揮相應的正反饋調節作用或負反饋調節作用。lncRNA TINCR是一種非典型lncRNA，其在體細胞組織分化以及腫瘤進程中均具有重要作用[5]。本研究探討分析HCC外周血lncRNA TINCR表達水平與TACE術后輔助性T淋巴細胞1(Th1)/Th2平衡及預后相關性，為進一步揭示HCC介入治療的預后情況提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性選取2015年3月—2017年3月本院行TACE治療的HCC患者。隨機抽取在本院體檢的健康志愿者作為對照組。納入標準：(1)治療前經超聲、CT或2種以上影像學檢查確診為HCC；(2)經病理檢查確診為原發性肝癌；(3)凝血功能正常；(4)介入治療術前未接受放療或化療治療；(5)預計生存期>3個月；(6)TNM分期 Ⅱ～Ⅲ 期；(7)患者自愿簽署知情同意書。排除標準：(1)腹水中至大量；(2)合并其他惡性腫瘤患者；(3)合并嚴重心腦血管疾病患者；(4)合并精神疾病患者；(5)哺乳期或妊娠期女性；(6)TACE治療后1個月內并發嚴重感染患者；(7)合并自身免疫性疾病或免疫缺陷性疾病患者；(8)有TACE治療禁忌證患者。

1.2 方法

1.2.1 TACE治療方案 患者接受局部麻醉后，采用Seldinger穿刺法，經皮股動脈穿刺插管，將導管插入腫瘤供血動脈內，隨后注入造影劑，進行肝動脈造影，仔細觀察患者腫瘤位置、腫瘤大小以及供血情況。隨后依次注入5-氟尿嘧啶(1000～12 000 mg)、比柔多星(40～60 mg)進行栓塞化療，使用碘化油作為栓塞劑，部分患者可使用明膠海綿進行栓塞，術后給予患者抑酸、保肝、水化支持以及抗菌藥物等治療。TACE治療每4周1次，每例患者最多進行3次。

1.2.2 外周血lncRNA TINCR表達檢測 于TACE完成后7 d抽取患者清晨空腹外周靜脈血，對照組受試者于體檢當日抽取清晨空腹外周靜脈血。室溫下靜置15～30 min，離心10 min(3000 r/min，4 ℃)，小心吸取上清液置于試管內，再次離心10 min(2500 r/min，4 ℃)，留取上清后置于-80 ℃冰箱內保存待測。取上述血漿樣本，每份400 μl，采用Qiagen miRNeasy Serun/Plasma kit試劑盒使用說明書提取血漿內總RNA，并使用紫外分光光度計測量總RNA濃度，經反轉錄后，使用real-time PCR檢測血漿中lncRNA TINCR相對表達量，TINCR上游引物5′-CCATCCCTCTGTAACCACCT-3′，下游引物5′-GTTGGGTCTAGATTCCAGCA-3′；使用Actin作為內參基因，Actin上游引物5′-ATCATGTTTGCCTAGATCAACA-3′，下游引物5′-GATCTCTTGCTAAGCGTCCA-3′。引物均由上海生工生物工程有限公司設計合成。real-time PCR反應條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 35 s、72 ℃ 30 s，共40個循環；72 ℃ 10 min。采用2-△△CT法表示lncRNA TINCR相對表達量。

1.2.3 Th1/Th2細胞因子檢測 HCC組患者于TACE完成后7 d抽取患者清晨空腹外周靜脈血，對照組受試者于體檢當日抽取清晨空腹外周靜脈血，離心15 min(3500 r/min，4 ℃)，取上清液，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清IFNγ、IL-2、IL-4以及IL-10水平，檢測試劑盒購于美國R&D公司，檢測嚴格參照試劑盒使用說明書進行。

1.2.4 術后隨訪 TACE術后對患者進行隨訪，隨訪方式包括門診隨訪、電話隨訪等，隨訪截止日期為2019年8月1日，以患者死亡作為隨訪終點事件。

1.3 倫理學審查 本研究方案經由湖北省武漢市金銀潭醫院倫理委員會審批，批號：倫審2017-02A。

2 結果

2.1 一般資料 共納入HCC患者85例，其中男46例、女39例，年齡29～76歲，平均(55.72±14.29)歲；Child-Pugh分級A級26例、B級53例、C級6例；血管侵犯64例；腫瘤大小>5 cm 51例、≤5 cm 34例；臨床分期Ⅱ期44例、Ⅲ期41例。另選取對照組30例，其中男17例、女13例，年齡30～75歲，平均(54.28±15.20)歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P值均>0.05)。

2.2 外周血lncRNA TINCR相對表達量比較 HCC組患者外周血lncRN TINCR相對表達量(1.784±0.429)高于對照組(0.926±0.263)，差異有統計學意義(t=10.277，P<0.05)。

2.3 lncRNA TINCR相對表達量與HCC患者病理特征分析 lncRNA TINCR相對表達與HCC患者血管侵犯、腫瘤大小、腫瘤分期及血清AFP水平有關(t值分別為3.958、4.499、3.361、4.949，P值均<0.05)(表1)。

表1 lncRNA TINCR相對表達量與HCC患者病理特征分析

2.4 Th1/Th2細胞因子表達水平比較 HCC組患者血清IFNγ、IL-2水平明顯低于對照組(t值分別為11.408、6.986，P值均<0.05)，而IL-4、IL-10水平明顯高于對照組(t值分別為6.426、6.909，P值均<0.05)(表2)。

表2 兩組受試者Th1/Th2細胞因子水平比較

2.5 HCC患者lncRNA TINCR相對表達量與Th1/Th2細胞因子的相關性分析 HCC患者外周血lncRNA TINCR相對表達量與血清IFNγ、IL-2水平呈負相關(r值分別為-3.164、-3.270，P值均<0.001)，與患者血清IL-4、IL-10呈正相關(r值分別為2.963、3.044，P值分別為0.007、<0.001)。

2.6 lncRNA TINCR相對表達量與患者預后關系 以lncRNA TINCR相對表達量≥1.700作為高表達，85例HCC患者中lncRNA TINCR高表達患者47例，低表達患者38例。log-rank檢驗結果顯示，lncRNA TINCR低表達患者生存情況明顯優于高表達患者(χ2=4.182,P<0.05)(圖1)。

圖1 lncRNA TINCR相對表達量與患者預后關系

3 討論

HCC血供75%～80%均來自于肝動脈，TACE介入治療可有效阻斷HCC供血動脈，導致腫瘤組織缺血、缺氧而發生壞死，尤其對于中晚期HCC患者而言，由于癌細胞發生擴散，多合并淋巴結轉移或遠處轉移，TACE是目前首選治療方案，但患者5年生存率仍然較低[6-7]。lncRNA目前已被證實在人體染色體重組、修飾過程中具有著重要的調控作用，可誘導組蛋白修飾，進行RNA選擇性剪切，在基因啟動子干擾以及蛋白質活性中發揮著重要作用，同時可作為腫瘤生物標志物，在腫瘤發生發展的診斷方面有重要價值[8-9]。研究[10]顯示，TINCR在膀胱癌組織中表達上調，促進了膀胱癌的發生及發展，此外，抑制TINCR表達可抑制腫瘤細胞增殖而促進細胞體外凋亡，認為TINCR是膀胱癌治療的潛在靶點。同時，研究[11]顯示，在HCC組織中可出現TINCR的異常表達，并認為該種異常表達與患者臨床病理特征有密切關系。

本研究選取TACE治療的HCC患者作為研究對象，分析患者外周血lncRNA TINCR表達情況及其與患者術后Th1/Th2平衡和預后相關性。研究結果顯示，與正常對照組相比較，HCC患者TACE術后仍存在lncRNA TINCR的高表達，且表達情況與患者血管侵犯、腫瘤大小、腫瘤分期及血清AFP水平有關，與相關研究[12-13]結果一致，提示HCC患者的lncRNA TINCR高表達與HCC的疾病進展程度有關，進一步證實了lncRNA TINCR與HCC的發生發展具有著密切的聯系。

T淋巴細胞所介導的細胞免疫在機體排斥腫瘤過程中發揮著重要作用，Th1/Th2極化作為機體免疫應答的重要環節，對腫瘤發生發展有重要影響[14-15]。Th1細胞可分泌IFNγ、IL-2等細胞因子，參與抗腫瘤細胞免疫過程；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-10等細胞因子，參與體液免疫過程，同時具有抗Th細胞作用[16]。在正常機體內，Th1/Th2細胞處于平衡狀態，在惡性腫瘤患者中表現為Th1/Th2平衡破壞，出現Th1/Th2漂移。本研究結果顯示，HCC組患者血清IFNγ、IL-2水平明顯低于對照組，而IL-4、IL-10水平明顯高于對照組，提示與健康人群相比較，HCC患者表現為Th1細胞功能減弱以及Th2細胞功能升高，患者Th1/Th2細胞平衡以Th2作為優勢細胞，與相關研究[17-18]結果一致，這種免疫功能的改變被認為可能與腫瘤的發展有密切聯系。

分析患者lncRNA TINCR表達與Th1/Th2細胞平衡之間的相關性，結果顯示，HCC患者外周血lncRNA TINCR相對表達量與患者血清IFNγ、IL-2呈負相關，與患者血清IL-4、IL-10呈正相關，提示lncRNA TINCR與腫瘤的免疫調節有關，可能是TINCR調控腫瘤進展的機制之一[19-20]，但仍需要進行進一步的研究證實。此外，分析lncRNA TINCR表達對患者TACE治療后生存情況的影響，結果顯示，lncRNA TINCR低表達患者生存情況顯著優于高表達患者，提示lncRNA TINCR與HCC患者治療預后密切相關，可作為患者預后預測的潛在指標[21]。關于lncRNA TINCR對HCC的影響，可能考慮lncRNA TINCR對患者機體免疫功能的調控，但是關于其具體的分子機制尚未闡明。

綜上所述，HCC血管介入治療患者術后外周血lncRNA TINCR表達明顯高于健康人群，而lncRNA TINCR表達與患者病理特征及Th1/Th2免疫平衡有密切聯系，可作為患者生存預后的潛在預測指標之一，值得進一步深入研究分析。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：柏濤、王靜麗負責課題設計，資料分析，撰寫論文；夏冰、程海林、王娟參與收集數據，修改論文；胡旭東負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。