錯配修復蛋白MLH1、MSH2、PMS2、MSH6及p53在結直腸癌中的表達及意義

潘思瓊，陸奉科 ，李山

1.廣西醫科大學第一臨床醫學院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學第四附屬醫院病理科，廣西 柳州 545000；3.柳州市婦幼保健院輸血科，廣西 柳州 545000

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是消化道較為常見的惡性腫瘤之一，發病率位居全球惡性腫瘤第三位，也是中國癌癥死亡的第二大原因[1]。在歐洲，2018 年估計有38.8 萬例新發病例和17.4 萬例相關死亡病例。我國每年新增病例超過25 萬例，約14 萬患者死于CRC[2]。研究報道，10%～20%的散發性結直腸癌與DNA 錯配修復蛋白(mismatch repair proteins，MMRP)功能的損傷有關，錯配修復缺陷導致遺傳不穩定，即微衛星不穩定性(microsatellite instability，MSI)[3]。約 40%的 CRC 病例中發現 p53 突變，p53 突變體可獲得加速惡性進展、增加腫瘤侵襲和轉移功能，在CRC 發育過程中可以發揮一個非常重要的作用。本研究采用免疫組織化學方法對結直腸癌組織標本中錯配修復蛋白(MLH1、MSH2、PMS2、MSH6)和p53 進行檢測，分析其與臨床病理特征之間的關系，為結直腸癌的臨床治療和預后評價提供一個有效的參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集廣西醫科大學第四附屬醫院2019 年1 月至2020 年6 月經病理確診的結直腸癌標本261例，標本術前均未經過化療或放療，所有患者有較完整的臨床資料。其中男性162 例，女性99 例；年齡29～92歲，中位年齡62歲。本研究受醫院醫學倫理委員會認可。

1.2 主要試劑 鼠單抗MLH1、鼠單抗MSH2、兔單抗MSH6、兔單抗PMS2及鼠單抗p53均購自福州邁新公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)、MaxVision-HRP 鼠/兔免疫顯色試劑、DAB顯色液均由病理科提供。

1.3 方法 所有標本經10%中性福爾馬林進行固定，脫水，石蠟包埋，選取4 μm 切片，經65℃烤片2 h，脫蠟水化，抗原修復(EDTA 緩沖溶液高壓熱修復)，浸泡3%H2O2，阻斷內源性過氧化酶的活性，滴加一抗，室溫孵育1 h，PBS 緩沖液沖洗，再滴加二抗，室溫孵育20 min，PBS緩沖液沖洗，DAB顯色液顯色，蘇木素復染胞核，鹽酸分化，梯度酒精(低至高)進行脫水，中性樹膠封片。

1.4 結果判斷 MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 均定位于細胞核，胞核呈現黃色或棕黃色顆粒則判斷為陽性表達，胞核不著色為缺失。MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白中任意一種缺失判定為MSI。p53表達出現于細胞核，核呈黃色或棕黃色判斷為陽性。所有免疫組化結果由兩位經驗豐富的資深病理學專家共同診斷。

1.5 統計學方法 采用SPSS25.0 軟件進行統計學分析，計數資料采用連續校正χ2檢驗；采用Spearman等級相關分析各指標之間的相關性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MMRP、p53 在 CRC 中的表達 261 例 CRC中MMRP 陽性者為248 例(95.0%)，表達缺失者為13例(5.0%)，其中MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 表達缺失者分別為 7 例(2.7%)、3 例(1.1%)、8 例(3.1%)、4 例(1.5%)。 MLH1 和 PMS2 共 同 表 達 缺 失 者 為 7 例(2.7%)，MSH2 和 MSH6 共 同 表 達 缺 失 者 為 2 例(0.8%)。p53陽性表達者為211例(80.8%)，陰性表達者50例(19.2%)，見圖1。

2.2 MSI、p53 表達與 CRC 臨床病理特征的關系 MSI 與結直腸癌患者性別、腫瘤直徑、年齡、部位、分化程度、淋巴結是否轉移及腫瘤浸潤深度均無關(P＞0.05)，p53與患者性別有關(P＜0.05)，見表1。

2.3 MSI 與 p53 的相關性 MSI 與 p53 表達無相關性(r=-0.111，P＞0.05)，見表2。

圖1 MMRP蛋白、p53在CRC中的陽性表達(10×10)注：A，MLH1 在 CRC 中的陽性表達；B，MSH2 在 CRC 中的陽性表達；C，MSH6 在CRC 中的陽性表達；D，PMS2 在 CRC 中的陽性表達；E，p53 在CRC中的陽性表達。

2.4 MLH1 與 PMS2、MSH2 與 MSH6 的 相 關性 MLH1 與 PMS2 表達呈正相關(r=0.934，P＜0.05)，MSH2與MSH6表達呈正相關(r=0.572，P＜0.05)，見表3。

MLH1PMS2 MSH2 rs值P值MSH6rs值P值-+-7 1+0＜0.050.072+0 0.572＜0.05 253-+-3 1 257

3 討論

CRC是胃腸道系統中一種異質性惡性腫瘤，它是由多階段及多種因素發展而來的復雜性疾病，其病因可能與生活方式(吸煙、飲酒等)、個體不同的遺傳背景、環境因素以及腸道菌群與宿主免疫系統的動態失衡有關[4]。錯配修復基因是DNA 損傷反應通路的一個重要組成部分，負責維持基因組的完整性[5]，包括MLH1、MSH2、PMS2、MSH6等。MMRP能很好地糾正微衛星中的移碼突變和DNA復制過程中產生的不匹配核苷酸，其表達異常可導致腫瘤抑制基因、原癌基因或DNA修復基因突變，使正常結腸上皮細胞轉化為腫瘤細胞[6]。而微衛星不穩定是指短串聯重復序列(編碼區和非編碼區)普遍不穩定，在DNA修復過程中，錯配修復基因編碼相應的酶，也可以識別堿基對，如果MMR缺陷或突變會損害細胞DNA能力，可能會導致細胞死亡或基因組不穩定[7]。因此，MMRP中的MLH1、MSH2、PMS2、MSH6在結直腸癌發生發展過程中具有重要意義。

本研究發現，261 例 CRC 中 MSI 發生率為 5.0%，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6表達缺失者分別為2.7%、1.1%、3.1%、1.5%。根據胡曉儒等[8]研究658例結直腸癌中錯配修復蛋白的表達，結果顯示MSI 發生率為6.7%，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6、表達缺失者分別為4.1%、2.3%、4.3%、2.4%，與本實驗結果相近。而另據國內外有文獻報道MMRP 表達缺失率在15%左右[9-10]，這一發現可能反映了MMRP在不同人種、不同地域間存在差異，也可能與遺傳因素和生活方式與腫瘤的特征密切相關。此外，統計學分析顯示，MSI的表達缺失與性別、年齡、部位、腫瘤直徑、腫瘤分化程度和細胞浸潤深度無相關性，與淋巴結轉移有關，其發生機制有待進一步研究。PMS2的缺失與發病部位有關，發生在右半結腸較為多見，這可能與各種生物學和臨床差異，包括胚胎起源、生理功能和血管供應相關[11]。右側結直腸來源于中腸，由腸系膜上動脈供血，常表現為全基因組的高甲基化、MSI-H高突變。而左側結直腸來源于后腸，由腸系膜下動脈供血，包括染色體不穩定所導致。

在本次研究對象中，MLH1 和PMS2 共同缺失者有 7 例，MSH2 和 MSH6 共同缺失者有 2 例，MSH2 和MSH6、MLH1 和 PMS2 均呈正相關(r=0.934，P＜0.05；r=0.572，P＜0.05)，表 明 MLH1 和 PMS2、MSH2 和MSH6 經常共同缺失或表達，可能與蛋白質異源二聚體、MSH2 二聚體和 MSH6、MLH1 二聚體和 PMS2 分別形成功能復合物大腸桿菌(MutS inhibitor)和大腸桿菌(MutL inhibitor)有關，MSH2蛋白是其異源二聚體的先決條件，MSH2 突變可導致 MSH2 和 MSH6 蛋白同時缺失[12]。而MLH1缺失是MMRP中最常見的模式，其原因可能是由于MMRP缺失時，MLH1基因進行啟動子高甲基化，使其在DNA損傷修復中分別與其同源性MMRP形成復合體導致MMR蛋白表觀遺傳癥狀[13]。

p53 基因是最重要的腫瘤抑癌基因之一，位于17號染色體的短臂，參與組織細胞凋亡或細胞生命周期阻滯、DNA 損傷修復等過程[14]。p53 基因突變是導致腫瘤進展的主要原因，大約50%的癌癥患者中發現其突變[15]。有研究顯示，突變型p53 CRC 患者比野生型p53 患者化療耐藥更嚴重，反映了p53 突變狀態在CRC 進展及預后不良中發揮重要的作用[16]。在本次研究中p53的陽性率為80.8%，與性別有關，與腫瘤細胞浸潤深度、淋巴結轉移無關，p53 表達與MSI 無相關性，實驗結果與其他文獻的研究結果有所差異。可能是由于觀察到的p53過表達不一定與p53基因突變有關。不同類型p53 突變引起的致癌機制不同，野生型p53 的缺失影響侵襲過程，突變型p53 獲得功能獲得(GOF)活性，也可能是由于MSS 型和MSI 型結直腸癌具有不同的致癌機制和通路，而且地域種族、其他遺傳或非遺傳、非標準化操作等因素也可導致結果不一致。

綜上所述，結直腸癌中錯配修復蛋白表達的部分缺失，與其臨床病理特征關系密切。p53 表達與MSI是否存在聯系，尚需要多中心大量的標本進行進一步的研究證實。而通過檢測MMRP及p53指標，對CRC的早期進行診斷、風險管理評估及預后評價具有一定的參考意義。