黃連素調節miR-29b抑制高糖誘導的MPC-5足細胞上皮-間質轉化研究*

郭小雷

（天津中醫藥大學第一附屬醫院急癥部，天津 300381）

糖尿病腎病（DKD）是由糖尿病引起的最嚴重的并發癥，也是終末期腎病最常見的病因，其中足細胞病變是DKD的主要病理表現之一。足細胞是腎小球臟層上皮細胞，對維持腎小球的結構、形態、濾過屏障的正常功能具有重要作用[1]。病理情況下足細胞損傷后出現上皮向間充質細胞轉分化（EMT），獲得分泌功能，促使細胞外基質分泌增多，最終引起腎小球硬化及纖維化[2]。而減輕足細胞損傷能可延緩DKD進展[3]。

miRNAs是一類長度約18～22 bp的非編碼小分子RNA，在糖尿病及DKD的發生發展過程中起著重要的調控作用。其中miR-29b與腎纖維化相關，其在鹽敏感小鼠、單側輸尿管梗阻小鼠及鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠的腎臟中均表達下降[4]。降低的miR-29b無法抑制膠原基質的形成，導致腎纖維化的發生發展。

糖尿病腎病在中醫屬于“消渴病腎病”范疇。黃連是傳統的清熱類中藥，在治療消渴的方劑中多有使用，魏晉時的《名醫別錄》就有“黃連止消渴”的記載[5]。黃連素是由中藥黃連等中提取出的生物堿，循證醫學證據表明，黃連素通過降低血糖、膽固醇、C-反應蛋白的作用，不但降低血液黏稠度，從血流動力學方面改善腎小球的濾過能力，還可以減少對血管包括微血管的損害，治療糖尿病腎病，降低尿蛋白[6]。前期臨床實踐發現，重用黃連的方劑對DKD有較好療效。但黃連素對足細胞的保護作用，特別是保護足細胞免于EMT轉化的機制研究較少，且這種保護作用是否由miR-29b介導也不清楚。因此，本研究擬將腎小球足細胞損傷與miR-29b相聯系，探討黃連素對足細胞損傷的作用，為臨床采用黃連素治療DKD提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 黃連素、二亞基化砜（DMSO）、干擾素-γ（IFN-γ）、重組人轉化生長因子-β1（TGF-β1）購自Sigma公司，青鏈霉素雙抗混合液、0．25%胰蛋白酶購自Solarbio公司，RPMI 1640購自Hyclon公司，胎牛血清、Opti-MEM Reduced Serum Medium購自Gibco 公司：Trizol、miScript Reverse Transcriptase Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、Lipofectane 2000 購自Qiagen公司。限制性內切酶、雙螢光素酶報告基因試劑盒（Renilla-Firefly Luciferase Dual Assay Kit）購自美國Promega公司；RIPA裂解液、電泳緩沖液、轉膜緩沖液等購自博士德公司；PVDF膜購自Millipore公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA，MA5-11547）和肌間線蛋白（desmin，MA5-16357）單抗、podocin（PA5-37284）多抗購自 Thermo Fisher Scientific公司。ELISA試劑盒購購自德國IBL公司。

所用儀器為Nikon光學顯微鏡、Bio-Tek 800酶標儀、Bio-rad凝膠圖像分析系統、ABI 7500型熒光定量PCR儀等。

1.2 方法

1.2.1 足細胞培養和分組 將凍存的MPC-5條件永生化小鼠足細胞復蘇，在含有10 U/mL IFN-γ、10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養液中，33℃、5% CO2培養箱傳代。傳代后在37℃、5% CO2培養箱內用無IFN-γ的培養基培養10～14 d使細胞分化。

1.2.2 黃連素對MPC-5細胞轉分化的影響 取對數生長期的細胞，調整密度為1×105個細胞/mL，接種于 96 孔板，每孔 100 μL，于 37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞融合后，更換無血清培養基繼續培養8 h使細胞同步。將細胞分為正常組（Control，5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（HG，30 mmol/L葡萄糖）和高糖+50 μmol/L 黃連素組（HG+Ber）。正常組常規培養；其余各組使用相應培養基培養48 h。酶聯免疫吸附（ELISA）法測定培養液上清液中的TGF-β1；收集細胞，實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）法測定miR-29b表達；Western blot法檢測EMT相關蛋白 α-SMA、desmin、podocin的表達。

RT-qPCR法：收集各組細胞，提取總RNA后測定純度和濃度，將5 μg總RNA逆轉錄為cDNA。將cDNA、引物、熒光染料等加入反應體系中，依試劑盒說明書進行RT-qPCR檢測。PCR反應條件：95℃10 min，95℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共 40 個循環。反應體系為20 μL。引物由上海生工合成。引物序列：mmumiR-29b逆轉錄引物采用莖環結構，為5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAACACTGA-3'，RT-qPCR引物為5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCACCATTTGAAA-3'和5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'，內參U6 snRNA引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'和5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。所有樣品重復檢測 3 次，2-ΔΔCt法計算 miR-29b的相對表達量。

Western blot法檢測蛋白表達：收集各組細胞，RIPA提取液提取總蛋白，BCA法定量后，蛋白樣品進行10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、封閉后，分別與 α-SMA（1∶1 000）、desmin（1∶1 000）、podocin（1∶1 000）的一抗雜交，再經與 HRP 標記的二抗雜交、化學發光顯色等步驟，Bio-rad凝膠圖像分析系統測定光密度值。每個樣品重復測量3次，取均值分析，實驗以GAPDH作為內參照物。

1.2.3 miR-29b過表達對轉分化的影響 取對數生長期的細胞，調整密度為1×105個細胞/mL，接種于12孔板。將細胞分為正常組（Control，5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（HG，30 mmol/L葡萄糖）、高糖+miR-29b mimic NC組（HG+mimic NC）和高糖+miR-29b mimic組（HG+mimic）。于37℃、5% CO2培養箱中培養至60%～70%融合后，更換無雙抗培養基培養過夜。更換Opti-MEM培養基，在Lipofectamine 2000的介導下轉染miR-29bmimicNC或mimic，培養6 h。更換各組相應培養基繼續培養至48 h。取培養液上清液，ELISA法測定其中的TGF-β1；收集細胞，Westernblot法檢測EMT相關蛋白α-SMA、desmin、podocin的表達。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-29b與TGF-β1是否直接結合 將TGF-β1基因3’-UTR克隆至pGL3質粒，構建pGL3-TGF-β1野生型載體和突變型載體。取對數生長期的細胞，調整密度為1×105個細胞/mL，接種于 12孔板，于 37℃、5% CO2培養箱中培養至60%～70%融合后，更換無雙抗培養基培養過夜。更換Opti-MEM培養基，在Lipofectamine 2000的介導下共轉染pGL3-TGF-β1野生或突變型載體及miR-29b mimic，5% CO2培養箱中37℃培養24 h。依雙熒光素酶檢測試劑盒說明書處理細胞，多功能酶標儀測定熒光強度。

1.2.5 下調miR-29b表達對黃連素抑制轉分化的影響 取對數生長期的細胞，調整密度為1×105個細胞/mL，接種于12孔板。將細胞分為正常組（Control，5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（HG，30 mmol/L葡萄糖）、高糖+50μmol/L 黃連素組（HG+Ber）、高糖+50 μmol/L黃連素+miR-29b inhibitor NC組（HG+Ber+inhibitor NC）和高糖+50 μmol/L黃連素+miR-29b inhibitor（HG+Ber+inhibitor）組。于 37℃、5% CO2培養箱中培養至60%～70%融合后，更換無雙抗培養基培養過夜。更換Opti-MEM培養基，在Lipofectamine 2000的介導下轉染miR-29b inhibitor NC或inhibitor，培養6 h。更換各組相應培養基繼續培養至48 h。取培養液上清液，ELISA法測定其中的TGF-β1；收集細胞，Western blot法檢測EMT相關蛋白α-SMA、desmin、podocin的表達。

2 統計分析

使用SPSS 24．0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較方差齊時采用LSD法，方差不齊時采用 Dunnett’s T3 法，P＜0．05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 黃連素對MPC-5細胞轉分化的影響 高糖培養48h后，高糖組miR-29b表達較正常組顯著降低；而高糖+黃連素組的miR-29b表達較高糖組明顯增加（P＜0．01）。高糖組培養液上清液中 TGF-β1 濃度較正常組上升，而高糖+黃連素組培養液上清液中TGF-β1 濃度較高糖組明顯下降（P＜0．01）。進一步分析顯示，高糖組EMT相關蛋白α-SMA、desmin表達較正常組上升，podocin表達較正常組下降，而高糖+黃連素組α-SMA、desmin表達較高糖組下降，podocin 表達較高糖組上升（均 P＜0．01）。見圖 1。

3.2 miR-29b過表達對轉分化的影響 與正常組相比，高糖組、高糖+miR-29b mimic NC組培養液上清液中TGF-β1濃度上升，而高糖+miR-29b mimic組的TGF-β1濃度較高糖組、高糖+miR-29b mimic NC 組明顯下降（P＜0．01）。與正常組相比，高糖組、高糖+miR-29b mimic NC組中α-SMA、desmin表達上升，podocin 表達下降（P＜0．01）。與高糖組和高糖+miR-29b mimic NC組相比，高糖+miR-29b mimic組α-SMA、desmin 表達下降，podocin 表達上升（P＜0．01）。見圖2。

圖1 黃連素對MPC-5細胞轉分化的影響Fig.1 Effect of berberine on the transdifferentiation of MPC-5 cells

圖2 miR-29b過表達對轉分化的影響Fig.2 Effect of over expression of miR-29b on transdifferentiation

3.3 雙熒光素酶報告基因實驗測試miR-29b與TGF-β1是否直接結合 雙熒光素酶報告基因實驗結果表明，轉染pGL3-TGF-β1野生型質粒時，熒光強度被明顯抑制，而轉染pGL3-TGF-β1突變質粒時，熒光強度與正常水平接近，提示miR-29b可直接作用于TGF-β1并抑制其表達。

3.4 下調miR-29b表達對黃連素抑制轉分化的影響 為了探索miR-29b與黃連素在抗EMT作用之間的聯系，向MPC-5足細胞內轉染miR-29b的inhibitor，并加入黃連素培養。

結果發現，與正常組相比，高糖組培養液上清液中TGF-β1濃度上升；與高糖組相比，高糖+黃連素組培養液上清液中TGF-β1濃度明顯下降；與高糖+黃連素組相比，高糖+黃連素+miR-29b inhibitor組培養液上清液中 TGF-β1 濃度明顯上升（P＜0．01）。

進一步分析顯示，高糖組EMT相關蛋白α-SMA、desmin表達較正常組上升，podocin表達較正常組下降；而高糖+黃連素組α-SMA、desmin表達較高糖組下降，podocin 表達較高糖組上升（P＜0．01）。與高糖+黃連素組相比，高糖+黃連素+miR-29binhibitor組 α-SMA、desmin表達上升，podocin表達下降（P＜0．01）。見圖 3。

4 討論

足細胞是構成腎小球濾過屏障的主要細胞之一，其覆蓋于腎小球基底膜表面，相鄰足細胞的足突相互交聯形成網狀結構，可阻止大分子蛋白濾過。在糖尿病的病理條件下，足細胞的結構和功能遭到破壞，出現數量減少、足突融合、分泌功能改變等異常，進而導致細胞外基質沉積、腎小球基底膜增厚，最終導致蛋白尿和腎小球硬化[1]。

研究顯示，足細胞損傷是腎臟疾病發生、發展至腎功能衰竭的主要原因。甚至在DKD早期，就已經發現足細胞出現損傷。足細胞發生EMT是導致足細胞結構與功能紊亂及腎小球濾過屏障損害的重要原因。podocin是特異表達于足細胞上的一種跨膜蛋白，與其他蛋白組成蛋白復合體固定于細胞骨架上，對維持足細胞結構完整性及腎小球濾過功能具有重要作用，還具有離子通道和信號轉導的功能[7]。desmin是細胞骨架中間絲蛋白，正常情況下足細胞僅少量表達desmin；但足細胞損傷時其細胞骨架發生重排，導致大量表達desmin。因此，desmin是足細胞損傷的標志蛋白[8]。α-SMA是間質細胞標志蛋白，正常情況下足細胞不表達α-SMA，但發生EMT時則大量表達α-SMA。α-SMA表達量的高低與腎間質纖維化程度及腎病的進展呈正相關[9]。

miR-29b在腎纖維化的發病機制中可能發揮了重要的調節作用。2型糖尿病患者血漿中miR29b表達減少[10]。miR-29b的水平與IgA腎病的蛋白尿和腎功能相關[11]。高糖處理人上皮細胞系后，miR-29b表達減少，而膠原蛋白Ⅳ表達增加[12]。對鹽誘導的高血壓大鼠和Dahl鹽敏感大鼠的研究表明，miR-29b能調節腎臟細胞外基質形成相關基因（如膠原基因，基質金屬蛋白酶2和整合素β1）的表達，增高miR-29b能使腎髓質免于纖維化[13]。鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠腎臟中miR-29b表達顯著降低[14]。

圖3 下調miR-29b表達對黃連素抑制轉分化的影響Fig.3 Effect of down regulation of miR-29b expression on inhibition of transdifferentiation by berberine

TGF-β1是促進腎纖維化發生發展的重要細胞因子[15]，既可以促進系膜細胞增殖和細胞外基質沉積，又能通過降低基質金屬蛋白酶的活性來抑制細胞外基質降解。研究顯示，miR-29b能負調控TGF-β1及其下游信號通路的活性，從而起到抑制細胞外基質形成的作用。高糖條件下，TGF-β1能降低miR-29b在腎小管上皮細胞和足細胞中的表達，并增加膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ的表達[16]。用TGF-β1處理的近端腎小管上皮細胞、系膜細胞和足細胞中，miR-29b水平降低，而細胞外基質蛋白合成增加。用miR-29啟動子抑制劑處理的腎細胞系，纖維化標志物表達增加[16]。本研究結果顯示，高糖處理使足細胞表達miR-29b減少，同時培養液上清液中TGF-β1濃度上升；轉染miR-29bmimic后，培養液上清液中TGF-β1濃度下降。雙熒光素酶報告基因實驗進一步證實miR-29b可與TGF-β1啟動子結合，從而抑制TGF-β1的表達。高糖處理還使足細胞表達EMT相關蛋白α-SMA、desmin表達上升，podocin表達下降；轉染miR-29b mimic后，可見α-SMA、desmin表達下降，podocin表達上升。提示過表達miR-29b可以減少TGF-β1水平，并降低足細胞EMT程度。

黃連素是一種生物堿，多種中藥如黃連、黃柏中均含有黃連素。以往研究證實，黃連素對糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、過氧化損傷、炎癥等諸多能引起DKD的病理機制，均有調節作用[17-18]，因此對DKD有較好療效。黃連素能降低DKD患者空腹血糖、糖化血紅蛋白及尿微量白蛋白排泄率[19]。黃連素能明顯降低2型糖尿病大鼠的血糖、血肌酐和24 h尿蛋白量[20]。黃連素能抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞增殖與肥大、改善腎小球纖維化，其起效機制與調節細胞周期蛋白表達、阻滯細胞周期進程[21]，抑制鞘氨醇激酶-1-磷酸鞘氨醇（SphK/S1P）通路活性[22]，抑制激活蛋白 1（AP-1）活化[23]，抑制核轉錄因子-κB（NF-κB）及其下游靶基因轉錄[24]等相關。本研究結果顯示，黃連素可減輕高糖處理對足細胞的不良影響，使miR-29b表達升高，TGF-β1水平降低，EMT相關蛋白α-SMA、desmin表達下降，podocin表達上升。轉染miR-29b inhibitor后，黃連素抑制足細胞EMT的作用減弱，表現為TGF-β1濃度上升；α-SMA、desmin表達上升，podocin表達下降。提示黃連素抑制足細胞EMT的作用需經miR-29b介導。

綜上所述，黃連素可以通過調節miR-29b水平，進而降低高糖誘導的足細胞表達TGF-β1、降低足細胞發生上皮-間質轉化的程度，從而在改善DKD癥狀方面發揮作用。