多組學技術應用于化學品風險評估的研究進展

魏若瑾，李濟彤，常靜，楊璐，潘一帆，王會利,*，朱莉飛

1. 中國科學院生態環境研究中心環境生物技術重點實驗室，北京 100085 2. 中國科學院大學，北京 100049 3. 北京市水產科學研究所，北京 100086

現代工業的迅速發展滿足了人們日益增長的物質需求，但也產生了越來越嚴重的健康和環境安全問題[1]。以各種方式進入到環境中的化學品種類和數量日益增加，而絕大多數的化學品毒性數據是缺乏的[2]。傳統的化學品風險評估依賴于動物實驗，難以對大量化學品的毒性進行高效檢驗與預測，并且對化學品作用機制的研究較為匱乏。為了對化學品毒性進行更加準確、可靠的評估，往往需要大量的毒性數據，不僅需要明確化學品影響生物系統的機制，還需要確定不同毒性通路共同的關鍵事件，以便更快速、更準確和更全面地評估化合物的潛在風險[3]。因此，亟需建立更科學有效的方法，用于評估那些毒理資料缺乏的化學品的環境風險與健康風險。

與此同時，生物學和毒理學領域也有了一些重大發展。生物信息學、檢測技術和計算分析能力的進步，以及在分子水平上對毒理學的理解，都有助于我們獲得更大數量、更多類型的可用信息和可靠數據，并可以應用于風險評估。正如Bradbury等[4]所指出的，我們要擺脫對體內測試的過度依賴，更多地使用計算、分子和體外工具。美國國家科學研究委員會(NRC)提出，需要收集歸納生物系統以及化學品干擾機制的基本信息，從而提高對化學品毒性效應的預測能力[5]。

組學是毒理學研究中強有力的且有很大發展前景的工具。隨著各種高通量組學方法在毒理學研究中的應用與發展，我們獲得了大量的組學數據，進一步加深了對化學品的毒性效應及分子機制的理解。多組學聯合分析的優勢主要在于，通過對各種組學數據的綜合分析，可以更全面、更系統和更深入地研究化學品在生物體內的作用通路，能夠為預測目標化學品的毒性機制提供更為可靠的理論依據和數據支撐[6]。

1 多組學研究的相關技術(Related techniques of multi-omics)

1990年，人類基因組計劃(Human Genome Project, HGP)啟動[7]，催生了組學的研究，包括基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學、脂質組學以及表觀遺傳組學等。組學分析技術已被證明是揭示復雜生物過程的強有力的新工具，并已成功地應用于微生物學、真菌學[8]、植物[9]和醫學[10]等領域。

1.1 基因組學

基因組(genome)，又稱染色體組，指一個物種單倍體的染色體數目，是物種全部遺傳信息的總和。基因組學(genomics)這一概念最早是在1986年，由美國科學家Roderick提出，基因組學的目的是對一個生物體所有基因進行集體表征和量化，研究它們之間的相互關系及對生物體的影響，并理解核苷酸序列的意義[11-12]。我們只有2個選擇：要么零敲碎打地去發現一個個重要的基因，要么就有選擇地測定數個動物(包括人類)的全基因組序列[13]。理所當然的，科學家們做出了科學的選擇，啟動了人類基因組計劃，開始了對基因組學的研究。“基因組序列圖”將奠定21世紀生命科學研究和生物產業發展的基礎。基因組學包括3個領域：(1)結構基因組學，包括基因定位、基因組作圖及測定核苷酸序列[14]；(2)功能基因組學，是指對基因功能的識別和鑒定；(3)比較基因組學，是對不同物種的整個基因組進行比較，增強對各個基因組功能和表達機理的認識[14]。基因組學技術正被應用于研究經化學物暴露后生物基因表達的變化，這些信息有助于更好地理解mRNA(轉錄組學)、細胞和組織蛋白表達(蛋白質組學)以及代謝譜(代謝組學)的信息[15]。目前，常用的基因組學技術有DNA測序[16-17]、下一代測序[18]和單核苷酸多態性微陣列[19]等。

1.2 轉錄組學

轉錄組(transcriptome)這一概念最早由Velcuescu等提出，轉錄組是特定發育階段或生理狀態下細胞中轉錄出來的所有RNA總和[20-21]，發現和解釋轉錄組的復雜性是理解基因組功能的一個關鍵途徑[22]。轉錄組學是功能基因組學研究的重要組成部分，是一門在整體水平上研究細胞中所有基因轉錄及轉錄調控規律的學科[23]，依賴于對暴露動物組織中mRNAs水平變化的全基因組測量[24]。轉錄組學分析的主要目標是識別、表征和分類特定階段特定細胞、組織中表達的所有轉錄本，這些轉錄本可以量化轉錄組在病理條件下的差異表達[22]。迄今為止，轉錄組學是最先進和最成熟的組學技術[25]。轉錄組學技術主要有微陣列技術[26]、基因表達系列分析技術[27]、大規模平行測序技術[28]和RNA測序技術[29]等。

1.3 蛋白質組學

蛋白質組(proteome)一詞是1994年由Wilkins和Williams提出的，是指在特定時間、特定條件下，在特定類型的細胞或個體中表達的所有蛋白質[30]。蛋白質組學(proteomics)主要闡明蛋白質的成分、結構、表達和功能模式及各種蛋白質之間的相互作用[31]。與人類基因組計劃相呼應，2001年，在美國成立了國際人類蛋白質組研究組織(Human Proteome Organization, HUPO)，提出了人類蛋白質組計劃[32]。雖然，基因指導蛋白質的合成，但基因表達的水平不能代表細胞內活性蛋白的水平[33]。蛋白質組極其復雜并且隨時間變化而改變，蛋白質修飾過程如磷酸化、糖基化等，對細胞內的穩態起至關重要的作用[34]。蛋白質組學對蛋白質翻譯和修飾水平的研究進行了補充，是全面了解基因組表達的重要手段[35]。蛋白質組學相關技術的發展促進了對蛋白質的定性定量檢測，但它仍然不如轉錄組學和代謝組學敏感[36]。蛋白質組學可分為：(1)表達蛋白質組學，即對組織、器官、細胞和亞細胞中蛋白質表達譜的研究；(2)結構蛋白質組學，是對蛋白質及其復合物三維結構的測定，從原子分辨率的水平對其作用機制進行解釋；(3)功能蛋白質組學，研究蛋白質在定位、折疊和修飾等功能上的不同和差異[37]。蛋白質組學技術有二維凝膠電泳技術[38]、質譜技術[39]等。

1.4 代謝組學

基因組學和蛋白質組學分別從基因和蛋白質層面探尋生命的活動，而實際上細胞內很多生命活動是發生在代謝層面的，基因和蛋白表達的有效的和微小的變化會在代謝物上放大，從而使檢測更容易。與蛋白質和基因相比，代謝物會立即對細胞進程造成直接影響，并與毒理學表型密切相關[40]。而且，代謝組學可以使用體液如血液和尿液作為基質，這些體液可以采用較少或無創的方法取樣，更加符合動物倫理，更加適用于人體健康的研究[25]。代謝組學的發展是基因組學、轉錄組學、蛋白質組學及表觀基因組學發展的必然結果。代謝組學是從基因到生命有機體的級聯過程的最后一步，它展現了生命有機體系統的當前狀態，展現了環境與其自身遺傳、轉錄和蛋白質表達共同作用的結果。代謝組學在現有的英文表述中，同時存在2個不同的詞匯和概念，即Metabolomics和Metabonomics，Metabolomics研究的是細胞中所有小分子的成分和波動規律，Metabonomics動態跟蹤完整生物體中的代謝物，研究其對內因和外因變化應答規律[41]。代謝組學的研究方法分為非靶向代謝組學和靶向代謝組學。非靶向代謝組學是對樣品中所有可測量的代謝物進行系統全面的分析，靶向代謝組學則只對特定的代謝物進行定性定量分析[42]。與非靶向代謝組學相比，靶向代謝組學只對已知可能具有生物學效應的幾種或幾類代謝物進行偏向性研究，數據處理更加簡單，分析更具有針對性[43]。Chai等[44]采用超高效液相色譜-質譜聯用技術(UPLC-MS/MS)進行靶向代謝組學分析，探討多氯聯苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)PCB91和PCB149對斑馬魚胚胎和幼體的毒性作用。PCB91/149暴露后，胚胎和幼體內的獨特代謝物大多為氨基酸，對22種氨基酸進行定量分析，對22種其他代謝物進行半定量分析，對暴露期間顯著改變的特征代謝物進行代謝途徑分析，在胚胎和幼體中觀察到的共同途徑是精氨酸和脯氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，表明這2種代謝途徑參與了細胞生長發育的遺傳調控和表觀遺傳調控。應用于代謝組學最廣泛的技術有色譜法、質譜法[45-46]及核磁共振法[47]等。

1.5 生物信息學

組學技術，特別是基因組學和蛋白質組學，產生了大量關于全基因組基因表達譜、蛋白表達以及蛋白質與外源性物質(特別是有毒物質)相互作用的數據，使研究跨越從分子到系統的多個復雜尺度[48]。對這些龐大數據進行處理和分析，進一步明確生物學機制，需要利用生物信息學這門關鍵學科。生物信息學結合了統計學、計算機科學和生物學等學科[7]，以計算機為工具，用數學和信息科學的方法對生命現象開展研究，已經成為組學研究的前沿學科之一[14]。目前，越來越多公開的生物信息數據庫可通過因特網訪問，例如Genbank、PDB(Protein Data Bank)和EMBL(European Molecular Biology Laboratory)等[49]。生物信息學分析的過程包括：(1)數據處理和分子識別；(2)統計數據分析；(3)通路分析；(4)數據建模[50]。生物信息學方法隨著組學技術的發展而發展，但是對于方法的應用還沒有建立起一個統一的標準，這是生物信息學面臨的挑戰，因為不同的生物信息學方法應用于相同的數據集可能產生截然不同的結論[51]。

2 多組學技術在化學品風險評估中的應用(Application of multiple-omics techniques in chemical risk assessment)

多組學是多種高通量組學技術的聯合應用，主要包括基因組學、轉錄組學、蛋白質組學及代謝組學等手段，對相關數據進行綜合分析，從而對作用機制進行更加深入的了解。早期的研究僅使用單一的組學技術進行毒理機制分析，然而，生命調控過程并不僅僅存在于單一層面，而是涉及到基因組、轉錄組、蛋白質組及代謝組等多個層面的共同作用。因此，聯合多組學技術，更加全面、系統地對化學品進行致毒機制研究和風險預測是勢在必行的。

2.1 風險預測

隨著全球化學品統一分類和標簽制度在各國的實施，對化學品鑒定及危險性預測技術的要求越來越高[52]。為快速識別并預測化學品的危險性，許多學者開始將多組學技術應用于化學品風險預測。Simoes等[53]為了揭示一種草甘膦類除草劑對土壤跳蟲的毒性機制，應用RNA測序和霰彈槍蛋白組學分別評估轉錄和蛋白表達差異。在Illumina HiSeq2000平臺上進行下一代測序，使用Bowtie軟件將測序結果與轉錄組進行比對，使用limma和edgeR軟件包，通過廣義線性模型進行回歸分析，并對偽發現率進行校正，得到差異表達的轉錄本。使用基質輔助激光解吸電離串聯飛行時間質譜(MALDI-TOF/TOF)對預處理后的樣品進行分析，使用ProteinPilot軟件對多肽和相應預測蛋白進行鑒定和相對定量。研究發現，此類除草劑暴露會影響正常的細胞呼吸和脂質代謝，誘導氧化應激，并導致蛻皮和生殖等生物生命周期活動發生損傷。Chatterjee等[54]應用了基于DNA微陣列的轉錄組學和基于GC-MS的脂質組學，對無定形納米二氧化硅粒子處理的人肝癌細胞(HepG2)進行生物信息學分析。研究使用MetaboAnalyst軟件進行代謝組學通路分析，使用IMPaLA軟件進行轉錄組學和代謝組學的通路整合分析，使用SPSS軟件對數據進行單因素方差分析。綜合顯著改變的基因和代謝物的通路分析，發現對膽固醇生物合成通路的調節取決于無定形納米二氧化硅粒子的比表面積，比表面積越大，誘導膽固醇的水平越高。這一研究結果將為納米材料暴露提供一個監管信號的范例。最重要的是，可以調整無定形納米二氧化硅粒子的表面積來控制誘導的膽固醇水平，并且為進一步的生物應用設計安全的方法。Gavin[55]利用轉錄組學和代謝組學技術，用非靶標方法進行大型溞的銀暴露研究，避免了傳統假設驅動研究方法的潛在局限性。使用IMPaLA軟件進行轉錄組學和代謝組學數據集的聯合通路分析，用Fisher精確檢驗進行數據分析。研究發現，銀暴露導致嘌呤核苷的積累與氧化應激無關，盡管鳥苷和肌苷顯著增加的確切原因需要進一步研究，這2種代謝物已被證明可以作為銀暴露的潛在標志物，從而用于風險預測、疾病診斷等。

2.2 致毒機制研究

化學品的毒性可能是急性毒性，也可能是慢性毒性，或是長期毒性、遺傳毒性和生殖發育毒性等等，只通過常規的急性毒性試驗難以準確評估其毒性效應及致毒機制，因此，亟需更加科學合理的技術，如多組學技術來進行化學品的致毒機制研究。Gonzalez-Ruiz等[56]在對3D神經細胞的三甲基錫暴露實驗中，構建了一個完整的框架來分析通過多因素、多平臺和多組學研究所獲取的數據，從而揭示三甲基錫誘導的生物合成路徑、神經元分化和信號轉導過程的改變。研究使用ANOVA multiblock OPLS(AMOPLS)方法將不同液相色譜-質譜聯用(LC-MS)平臺的代謝組學數據進行合并，分析不同實驗要素對三甲基錫暴露的影響，使用Proteome Discoverer軟件對多肽和蛋白質進行定性定量分析，通過將蛋白質組學和代謝組學得到的互補生化信息結合，可以更好地了解暴露于化學品后發生的復雜細胞變化。在此研究中，選擇的平臺依賴于生物圖譜數據庫，能夠同時將各種組學數據集與這些圖譜進行匹配。在一些圖譜中，顯著修飾蛋白的比例高于顯著修飾代謝物的比例，而在其他圖譜中則相反，說明2種組學方法的結合提高了可信度。Wilmes等[57]結合轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學與藥代動力學方法，研究了培養的人腎上皮細胞(RPTEC/TERT1)暴露于環孢素A(CsA)(一種有腎毒性的藥物)中的毒性效應。研究采用Illumina HT 12 v3芯片陣列(約47 000個轉錄本)進行轉錄組學分析；采用同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)技術標記多肽，用高效液相色譜-質譜聯用(HPLC-MS)技術測定，進行蛋白質組學分析；采用軌道離子阱(Orbitrap)進行代謝組學分析。研究發現，在高CsA濃度時，細胞內會同時出現線粒體紊亂、氧化應激和內質網應激現象。Grison等[58]研究了低劑量鈾對大鼠腎臟的慢性毒性。在此研究中，使用LC-MS分析樣本，將數據使用SIMCA-P軟件進行多元統計分析，使用Cytoscape的插件Metscape和MetaboAnalyst構建代謝網絡，檢測發現受到最顯著影響的2個代謝通路是煙酸-煙酰胺和不飽和脂肪酸的生物合成。轉錄組學相關分析采用RNA微陣列技術，所得原始數據使用R軟件分析，當調整后的P值低于0.5則說明基因發生差異表達，分析顯示有49個基因發生差異表達，其中，Nt5c2、Sirt6、Nnt、Nmnat1和Enpp3等基因可能與代謝物發生直接或間接的功能聯系。此研究結果揭示了慢性低劑量鈾暴露后，激活與氧化應激和炎癥免疫反應相關基因的細胞過程。

3 挑戰及展望(Challenges and prospects)

盡管多組學技術較傳統的動物實驗有巨大優勢，但將多組學技術應用于化學品風險評估中，仍然面臨一些挑戰。

把多組學技術應用于風險評估的首要挑戰就是如何與有害結局建立聯系[59]。風險評估的目的在于評估特定暴露方案造成有害結局的可能性。在人類健康評估中，有害結局可以被定義為個體出現疾病或不適。在生態評估中，有害結局可以定義為對種群及生態系統造成的影響。從本質上來講，組學終點反映的生物現象是較低層面的，例如分子層面、生物化學層面，而風險評估和有害結局通常關注器官、個體和種群層面。因此，要想將組學技術有效應用于風險評估中，就要在組學響應和有害結局之間建立科學可信的聯系。建立此種聯系的生物學依據基于對基因、轉錄、蛋白質和代謝等的理解。由于生物系統是復雜的，我們對生物系統的理解是有限的，在應用組學技術的時候可能會出現假陽性的結果[59]，因此，運用多組學方法，多方面、多角度地對有害結局路徑中的關鍵事件進行分析比單一的組學方法更有說服力。

多組學技術應用于風險評估的另一大挑戰就是研究手段的標準化。盡管經過幾十年的研究，組學方法仍未能從科學研究轉向監管應用[60]。組學技術的監管實用性意味著監管研究必須具有可重復性和可解釋性，用于監管目的的數據生成過程需要標準化。目前，眾多機構與學者正致力于此。例如，歐盟的致癌基因組學項目為研究組學檢測的可重復性以及評估相關的生物信息學方法提供了一個良好的平臺[61]；美國食品和藥物管理局(FDA)組織了MAQC(Microarray Quality Control)項目，旨在建立基因芯片、新一代測序技術規范及數據分析標準[62-64]；DNA元素百科全書聯盟(ENCODE)是由美國國立衛生研究院(NIH)資助的跨國項目，自2003年開始運作，一直是基因組學領域分析手段標準化的主要貢獻者[65]。

傳統的健康風險評估是依據流行病學、動物實驗和體外實驗等數據確定人體暴露后是否會對健康造成不良影響以及造成不良影響的性質和特點，此種方法較多組學技術工作量大，數據不足。目前，越來越多的學者把多組學技術應用于人群暴露健康風險評估中。Luyten等[66]探討了母體的空氣污染暴露可能對胎兒產生的不利影響，發現探索基因組、轉錄組、表觀基因組、蛋白質組和代謝組的整個代謝途徑比其他方法更有代表性。Yao等[67]探討了全氟/多氟烷基化合物(perfluoroalkyl and polyfluoroalkyl substances, PFASs)暴露對人類健康產生的不利影響，發現PFASs會向細胞發出化學信號，進而向組織甚至器官發出信號，最終導致疾病。檢測并理解這些信號可以通過高通量組學技術來解決，包括轉錄組學、表觀基因組學、蛋白質組學和代謝組學。

毫無疑問，在未來，新化學品仍然會以一個相當快的速度投入生產并進入市場，對化學品進行風險評估的壓力將會越來越大，工作量將會越來越重，對理解毒性機制的要求將會越來越高。為了促進人類健康，維護環境安全，風險評估需要應用更可靠的新技術、新手段。隨著毒理機制研究的不斷深入，生物信息數據的大量收集，以及數據處理軟件的持續改進，多組學在化學品風險評估中必將起到越來越重要的作用。

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