枯草芽孢桿菌表達系統研究進展

馬平英，羅 雯，詹怡昕，吳楚楚，熊雨順，許小群，陳 梅

(南昌師范學院生物系，330032，南昌)

0 引言

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種理想型的模式生物，其應用價值很高，培養簡單快速，具有非致病性及良好的發酵基礎和生產技術等優勢，是目前生產各種工業用酶的理想表達宿主。但是目前，枯草芽孢桿菌表達系統仍然存在不完善的地方。本文主要介紹了枯草芽孢桿菌表達系統的發展和應用進展，旨在為枯草芽孢桿菌表達系統研究提供參考。

1 枯草芽孢桿菌的優點

枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性短桿菌，有鞭毛，進行依賴性運動，其運動細胞更易形成菌膜[1]。該菌耐熱，在土壤和腐敗的有機物中易于生存，且不含有外毒素和內毒素，在工業生產和制藥中被認為是一種安全的細菌[2]。并且一直被認為可生產復雜的環狀脂肽，包括表面活性素、伊圖林和豐霉素等，這些脂肽是很強的表面活性劑并具有抗菌活性，可應用于農業和醫學領域[3-5]。又因枯草芽孢桿菌生長發育迅速,能在廉價碳源中良好生長，易于生存繁衍，可分泌多種營養物質，具有優良的發酵基礎[6]，且能抑制多種菌類的生長，預示著其未來具有許多潛在的用途[7]。現已揭示了枯草芽孢桿菌中存在的大量調控相互作用和2個轉錄組學數據集，因此可以通過網絡成分分析以及模型選擇綜合分析轉錄因子活性并揭示轉錄調控網絡[8]。此外還發現了枯草芽孢桿菌中存在的整合與接合因子(ICEs)能促進水平基因轉移，這種轉移所具有的不相容性為轉移元件及其宿主細胞提供了選擇優勢[9]。

2 枯草芽孢桿菌表達系統的發展

一直以來，枯草芽孢桿菌都被用作生產與分泌工業相關酶的宿主。國內外關于枯草芽孢桿菌的研究與應用已有上百年的歷史，早期工作主要是分離鑒定、形態觀察以及各種功能的鑒定，目前的研究重心逐漸轉移到遺傳學與分子生物學領域。從環境和健康等角度出發，系統地了解革蘭氏陽性細菌至關重要，KOO[10]等構建了枯草芽孢桿菌的2個單基因缺失文庫，據此分析獲得了一系列功能基因，并提供了一套高通量表型分析方法，為研究革蘭氏陽性細菌的基因功能、代謝途徑以及調控網絡提供了豐富資源。

目前提高枯草芽孢桿菌轉化效率的方法主要有3種，一是利用多聚體質粒進行轉化；二是電穿孔法；三是原生質法。與大腸桿菌相比，枯草芽孢桿菌感受態細胞的轉化更難實現，研究者從不同角度就如何提高轉化效率進行了探索。YOKOI[11]等人設計了在2個不同受體菌之間實現基因傳遞的RK2系統，并優化了從大腸桿菌到枯草芽孢桿菌的基因傳遞。已有研究證明枯草芽孢桿菌的天然感受態菌株可以攝取多個不同的DNA分子，YE[12]等人基于這種現象設計并構建了枯草芽孢桿菌的未標記突變體，通過篩選對壯觀霉素具有抗性的pUS20轉化子來獲得靶突變，這種方法能夠以大約30%的頻率傳遞點突變。NADLER[13]等人利用宿主天然的感受性以及同源重組能力開發了一種異源基因表達調控的自動化系統，有效克服易形成包涵體、毒性基因劑量效應或無法達到代謝工程所需水平等弊端，實現了高效轉化及表達。這種方法適用性較廣，對DNA的機械損傷微乎其微。ZHAO[14]等人使用含有反向選擇標記mazF的枯草芽孢桿菌，成功構建了一個具有高轉化效率、高陽性率且操作簡便的新型質粒種間轉移系統，為芽孢桿菌的遺傳操作提供了一個新的方法。

基于枯草芽孢桿菌在生產重組蛋白中所起的重要作用，如何提高表達效率一直備受關注。TRAN[15]等人構建了在沒有LacI阻遏物的情況下使用IPTG誘導啟動子的無誘導表達質粒，并在枯草芽孢桿菌中實現了高效非誘導性表達，表達水平是誘導表達的37倍，該表達載體既可用于小規模基因表達的研究，也可用于大規模重組蛋白的生產。MARIAN[16]等利用基因工程手段開發了無標記基因缺失系統，用于優化枯草芽孢桿菌對蛋白質和低分子量物質。FU[17]等人利用包含不同信號肽的文庫DNA直接轉化枯草芽孢桿菌，對枯草芽孢桿菌分泌異源蛋白的最佳信號肽進行了系統篩選，顯著提高了AmyS的產量。而GILBERT[18]等則利用枯草芽孢桿菌分泌表達的特點，設計開發了SpyTag-SpyCatcher系統，實現細胞外的蛋白質-蛋白質結合，利用細胞外自組裝的優勢為蛋白質結合提供了一種新的靈活策略。RUANGURAI[19]等人將來自食品級植物乳桿菌BCC9546的天然質粒用作載體，基于高效組成型啟動子和信號肽的運用，在重組枯草芽孢桿菌中實現了淀粉酶的高效分泌型表達。結果表明谷氨酰胺ABC轉運蛋白的信號肽在必需氨基酸轉運中發揮作用，在開發有效的異源蛋白分泌表達系統中具有潛在的用途。

3 枯草芽孢桿菌表達系統應用進展

枯草芽孢桿菌的研究無論在理論還是產品應用開發等方面均已取得巨大成功，如工業發酵、傳統發酵食品制備和植物病害生物防治等。

3.1 枯草芽孢桿菌在工業上的應用

枯草芽孢桿菌培養成本低、耗費時間少且有利于環境，是一種重要的表達宿主，既是有益菌，又是表達外源蛋白的工具[20]，已廣泛用于合成生物學、代謝工程和工業酶的生產[21]。ZHOU等通過優化表達條件，實現了β-甘露聚糖酶(BcManA)在枯草芽孢桿菌中的分泌表達，細胞外BcManA產量達到6 041 U/mL，是迄今為止通過搖瓶培養獲得的最高產量，大大降低了該酶的生產成本[22]。重組枯草芽孢桿菌的發酵能力強，在大規模發酵中表現出特有的潛力，通過對發酵條件進行優化，已證明枯草芽孢桿菌WB600可以作為生產BglTO的合適宿主，其產物活性與已有商業酶相比更高效，有望在釀造工業中應用[23]。此外，胰蛋白酶[24]、轉谷氨酰胺酶(MTG)[25]、有機溶劑耐受蛋白酶(OSP)[26]、杜納糖[27]等多種工業產品均已成功在枯草芽孢桿菌中表達。

3.2 枯草芽孢桿菌在農業上的應用

枯草芽孢桿菌對人類是安全的，被界定為“GRAS”(Generally Recognized as Safe)，其在工業生產、疫苗開發、環境保護和肽庫構建中都起到重要作用[28-29]。將枯草芽孢桿菌MF497446施用到受鎘(Cd)污染的土壤中，可促進植物生長并消除(或至少減少)農作物中Cd的積累，確保食品安全，降低人類健康風險[30-31]。作為安全宿主，在枯草芽孢桿菌168中通過表達GGT(γ-谷氨酰轉肽酶)可以提高茶氨酸的產量[32]。

3.3 枯草芽孢桿菌在醫學上的應用

曲霉二糖在食品和醫藥領域中具有廣泛的應用前景，但卻無法大規模分離和提取曲霉二糖，而蔗糖磷酸化酶(SPase)可用于生產曲二糖，由于枯草芽孢桿菌一般被認為是安全的生物，WANG[33]等人首次在食品級枯草芽孢桿菌菌株中異源表達出了青春雙歧桿菌SPase，這為大規模制備曲二糖提供了基礎。芽孢的表達系統具有許多優點，包括安全性高、抵抗力高、成本低以及易制備，軍事科學研究院化學防御研究所宋天宇[34]等人構建表達有機磷水解酶和脫水酶的重組芽孢，結果顯示芽孢展示可能有助于有機磷降解酶的實際應用，并提供了有望降解有機磷化合物的生物修復方案。枯草芽孢桿菌在生產具有藥理活性的重組蛋白方面具有多種優勢，如質量和效率、安全性和分泌能力等，因此優于大腸桿菌。MAHDI[35]等人檢驗了將TPD(生物合成特立帕肽)以標簽融合形式表達和分泌到枯草芽孢桿菌外的可行性，SDS-PAGE和western blotting結果表明，hPTH(人甲狀旁腺激素)融合重組體成功表達并分泌到細胞外培養基中。抗菌肽由于其很少甚至是不會產生耐藥性，同時不會在機體內殘留得到科學家們的關注。PR-FO是一種新型的α-螺旋混合抗菌肽，具有較強的抗菌活性和較高的穩定性，具有發展成為新一代抗菌藥物的潛力。ZHANG[36]等人在枯草桿菌WB800N中成功表達了重組PR-FO，表達產物對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有較高的抑制活性，對人紅細胞的溶血活性較低。枯草芽孢桿菌是一種具有益生菌特性的內生孢子和生物膜形成細菌，其芽孢具有獨特的物理、化學以及生化特性，是口服疫苗遞送的強大平臺。通過構建一系列重組枯草芽孢桿菌菌株，測試了口服芽孢后狗的免疫應答能力，并據此建立了枯草芽孢桿菌用作腸道疫苗制劑的主要步驟[37]。研究也已證明枯草芽孢桿菌芽孢的口服遞送可抵抗草魚呼腸孤病毒感染[38]。

4 小結和展望

相比枯草芽孢桿菌而言，大腸桿菌仍然是藥物蛋白工業生產中最常用的宿主，因其較易實現遺傳轉化，依然是藥物開發項目先導階段的首選。相比之下，芽孢桿菌的使用還存在一些問題，例如缺乏合適的表達載體、質粒不穩定性、易發生蛋白質折疊錯誤等。

如今，枯草芽孢桿菌的完整基因組序列是已知的，未知基因的功能也已得到研究。基因組學和蛋白質組學等現代技術的廣泛應用，為進一步優化已經存在的枯草芽孢桿菌生產菌株鋪平了道路。隨著生物技術的發展，枯草芽孢桿菌底盤細胞的潛力也逐漸被揭示[39]。枯草芽孢桿菌是科學研究中的重要模式菌種，是一種具有極高研發潛力的微生物，其安全系數高、對環境無污染、高效且應用廣泛，現已逐漸發展成生物技術領域的熱點。隨著基礎研究和應用技術更深入的研究和推進，未來枯草芽孢桿菌將成為一個超級分泌細胞工廠[40]。