一株高效降解天然水稻秸稈的Penicillium oxalicum T1的篩選與鑒定

王金昌，靳 亮，占智高，況文東，關麗梅，陳俊輝

(江西省科學院微生物研究所，330096，南昌)

0 引言

水稻秸稈是世界上最豐富的木質纖維廢棄物之一，年產量約7.31 億t[1]。我國是農業大國，每年各種農作物秸稈資源量約7 億t(《中國農業年鑒》編委會，2018年)，其中水稻秸稈產量達2.3 億t。由于水稻秸稈蛋白質含量低、礦物質含量高、土壤降解慢，常被作為燃料直接焚燒，不僅造成資源浪費，而且會造成嚴重的環境污染。此外，水稻秸稈燃燒可減少土壤中的養分和微生物群[2]。水稻秸稈70%的干生物質由多糖組成，是可發酵糖的豐富來源。因此，水稻秸稈是一種豐富的非糧食、未充分利用的資源。水稻秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質素3種成分組成，這3種成分通過不同程度結合在一起，由于其堅固的結構使其降解難度增加，在自然降解的情況下非常困難[3]。工業上常采用高溫高壓或強堿進行預處理，但這些措施需要消耗能量和會污染環境。利用微生物處理水稻秸稈便成為近年來人們研究的熱點。與物理、化學等方法處理相比，微生物降解法具有投資少、操作簡單、不污染環境等優點。

目前報道的能降解天然水稻秸稈主要是真菌，如多輪青霉、總狀枝毛霉和煙色曲霉[4]。尹璐研究了簡青霉固態發酵對天然水稻秸稈降解效果和降解產物，但其發酵時間長，且發酵產物為長鏈脂肪烴、脂肪酸、脂類和芳香酚類物質[5]；賈金如利用粗糙脈孢菌Neurosporacrassa14-8和其他真菌協同固態發酵水稻秸稈產飼料蛋白[6]；Liu利用微生物群落MC1發酵降解水稻秸稈，所分析的15種有機物大部分屬于有機酸，但含量最高的化合物為乙酸乙酯，第4天達到13.56 g/L[7]；還有發酵水稻秸稈產氫[8]、產糖[9]、生物丁醇[10]、生物乙醇和沼氣的報道[11-12]。

利用微生物發酵水稻秸稈生產人類急需的燃料、飼料及化工產品，具有極其重要的意義和發展前景。微生物降解水稻秸稈酶活性高低決定了水稻秸稈被降解的程度和降解產物。從土壤中分離篩選到一株高效降解水稻秸稈的菌株草酸青霉(PenicilliumoxalicumT1)，可為水稻秸稈的資源化利用提供有效的菌種資源。

1 試驗部分

1.1 材料

1.1.1 篩選培養基 CMC-Na 10 g、(NH4)2SO41.4 g、MgSO40.3 g、KH2PO42 g、MnSO41.6 mg、FeSO45 mg、ZnSO42.5 mg、CoCl22.0 mg、瓊脂20 g，pH7.0，定容1L。

1.1.2 發酵產酶培養基 CMC-Na 10 g、(NH4)2SO44.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO42 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g(pH自然, 定容到1L)。

1.1.3 水稻秸稈降解 Mandel′s無機鹽營養液(NH4)2SO41.4 g、KH2PO42.0 g、尿素0.3 g、微量元素(MgSO4·7H2O 0.3 g、CaCl20.3 g、MnSO42.5 mg、FeSO4·7H2O 7.5 mg、ZnSO42.0 mg、CoCl20.3 g)，蒸餾水定容到1 L。

1.2 實驗方法

1.2.1 初篩方法 稱取土樣10 g，放入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，置于搖床150 r/min振蕩30 min后取出，逐級稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的6種濃度，將6種濃度的稀釋液分別涂布于羧甲基纖維素鈉平板上，于25 ℃培養3 d。待菌長出后，再接種于新的羧甲基纖維素鈉培養基上純化，直至獲得純菌株為止。

1.2.2 復篩方法 將步驟1.2.1分離的單個菌株分別點種于CMC平板上，25 ℃培養3 d，用1.0 g/L剛果紅染色30 min，傾去染液，再用1 mol/L的NaCl水溶液脫色1 h，測菌落直徑(d，cm)和水解圈直徑(D，cm)，采用Dp表示水解能力：Dp=(D/d)2。

1.2.3 菌株纖維素降解酶酶活測定 將復篩獲得的菌株按5%的接種量分別接種于發酵產酶培養基中，在搖床(25 ℃，150 r/min)培養3 d后，6 000 r/min離心10 min，取上清液即為制備的粗酶液。采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)測定濾紙酶活性和內切型葡萄糖苷酶活性，外切酶活性和β-葡萄糖苷酶活性[13]。

1.2.4 水稻秸稈降解實驗 將水稻秸稈于80 ℃烘干至恒重后，截成長度為 2～3 cm，分別稱取10 g的水稻秸稈于15個250 mL 錐形瓶，加入150 mL Mandel′s無機鹽營養液121 ℃滅菌 30 min。將草原青霉菌接種于裝有2 mL發酵產酶培養基的試管中，28 ℃、200 r/min、48 h后全部接入錐形瓶中，28 ℃、200 r/min直至水稻秸稈被降解成湯，同時分別每間隔24 h分別取樣進行固液分離，水稻秸稈殘渣80 ℃烘干至恒重后稱重，計算水稻秸稈降解率。

2 試驗結果與分析

2.1 篩選到一株具有纖維素降解能的Penicillium oxalicum T1

本課題組利用CMC-Na平板篩選到一株具有纖維素降解能力的真菌T1，菌落形態平坦，質地絨狀，菌絲體初期為白色，后期變為灰綠色，菌落形態見圖1。提取T1基因組，用真菌引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC進行PCR擴增，測序后在NCBI上BLAST的結果為Penicilliumoxalicum，故命名為：PenicilliumoxalicumT1，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號：CCTCC M2019608。

圖1 T1菌落圖

2.2 Penicillium oxalicum T1纖維素降解酶酶活測定

PenicilliumoxalicumT1，水解圈見圖2，Dp=(D/d)2=4，表明其具有較好的纖維素降解能。采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)測定其纖維素內切酶酶活為78.68 U/mL，濾紙酶酶活為30 U/mL，外切酶酶活為22 U/mL，β-Gase為39 U/mL。

圖2 T1號菌株的透明水解圈

2.3 草酸青霉Penicillium oxalicum T1降解天然水稻秸稈

用Mandel′s無機鹽營養液作為培養基，PenicilliumoxalicumT1在9 d內能降解天然水稻秸稈成湯液，見圖3。

(左圖為對照，右圖為降解結果圖)

PenicilliumoxalicumT1在發酵降解水稻秸稈1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d和9 d后，水稻秸稈殘渣干重分別為：9.67 g、8.61 g、8.21 g、7.84 g、7.71 g、7.56 g、7.27 g、6.86 g和3.53 g，計算水稻秸稈降解率分別為：3.3%、13.9%、17.9%、21.6%、22.9%、24.4%、27.8%、31.4%和64.7%。水稻秸稈降解過程見圖3，草酸青霉對水稻秸稈降解能力很強，前2 d能迅速軟化水稻秸稈，隨后菌體大量增殖，同時緩緩降解水稻秸稈，到了第9天，迅速把水稻秸稈固體降解成湯液，效果見圖4。

圖4 Penicillium oxalicum T1降解水稻秸稈效果圖

張冬雪篩選的菌株PenicilliumoxalicumWAF6 對水稻秸稈的降解率為45.72%；CMCase 活力在培養的第5天達到最大值29.35 U/mL[14]。穆春雷從玉米秸稈還田地區篩選出1株草酸青霉菌，能夠在低溫下高效降解纖維素，在搖床發酵培養第9天時，CMCase活力最高，達33.08 U/mL[15]。王洪媛等所篩選的Penicilliumoxalicum98MJ在培養5 d后，其對由小麥秸稈制備的秸稈木質纖維素的降解率為26.8%[13]。本實驗結果表明，PenicilliumoxalicumT1纖維素酶活高于已報道的菌株。

3 結論

從土壤樣品中分離得到具有纖維素酶的真菌PenicilliumoxalicumT1，其纖維素內切酶酶活為78.68 U/mL，濾紙酶酶活為30 U/mL，外切酶酶活為22 U/mL，β-Gase為39 U/mL。當水稻秸稈做為碳源，利用Mandel′s無機鹽營養液，菌株在9 d內能降解天然水稻秸稈成湯液，對水稻秸稈降解率達64.7%，高于已報道的菌株，是一株十分具有研究開發潛力的纖維素酶生產菌株。