免疫組化雙染SF-1/DOG1對不育癥患者睪丸活檢細胞的輔助診斷

武良美，袁 菊，王 璇，鞏 雪，馬恒輝，陸珍鳳，陳 輝

睪丸活檢病理學診斷是診斷不育癥患者睪丸中精子發生狀態的金標準，其主要臨床意義是判斷梗阻性無精子癥或非梗阻性無精子癥[1]。前者是指睪丸能夠產生精子，但輸精管道阻塞，精子無法順利排出，可通過實行外科手術解除梗阻；后者是指睪丸不能產生或產生少量的不成熟的精子，必須通過現代輔助生殖技術，改善患者的生殖水平[2-3]。本文探討常規福爾馬林固定的睪丸活檢細胞，經SF-1/DOG1免疫組化雙染與HE染色比較，讓病理醫師對睪丸生殖細胞成熟階段的形態學特征有了更為直觀的認識，從而對不育癥患者組織學分類、治療措施的選擇和預后提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2014～2018年中國人民解放軍東部戰區總醫院病理科及江蘇省南京市浦口區中心醫院篩選的28例無精子癥男性睪丸活檢標本。患者有關臨床參數和精子回收率的信息通過查看電子病歷獲得。

1.2 組織切片制備及HE染色活檢組織均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，3 μm厚連續切片，行常規HE染色。

1.3 組織學分型依據阿克曼外科病理學睪丸生殖病理(第10版)的診斷標準，按形態學分為5種組織學類型：(1)生精小管廣泛玻璃樣變，定義為包括廣泛硬化的所有生精小管，沒有可識別的生殖細胞或支持細胞；(2)唯支持細胞綜合癥，指生精小管中沒有任何成熟程度的生殖細胞，只有支持細胞存在；(3)成熟遲滯型，以存在生殖細胞為特征，但未成熟(即沒有可識別的細長精子細胞)；(4)精子發生低下，定義為活檢組織有精子發生，但程度有所降低(即生殖細胞成熟進展到晚期精子細胞，生精小管數量減少)；(5)生精功能正常。

1.4 免疫組化采用免疫組化雞尾酒雙染法染色，DOG1抗體(1 ∶25稀釋)購自Cell Marque公司；SF-1抗體(1 ∶50稀釋)購自R&D公司；免疫組化雙染檢測試劑盒購自北京中杉金橋公司。實驗步驟：(1)3 μm厚石蠟切片置于二甲苯和乙醇中脫蠟水洗；(2)高壓鍋中加入免疫組化抗原修復液，購自福州邁新公司(檸檬酸法)，高溫高壓修復5 min；(3)滴加免疫雙染檢測試劑盒試劑1(內源性過氧化物酶阻斷劑)50 μL，室溫孵育10 min，水洗畫圈，Ultra沖洗緩沖液浸泡清洗2 min×3次；(4)滴加DOG1抗體試劑50 μL，37 ℃孵育100 min，Ultra沖洗緩沖液浸泡清洗2 min×3次；(5)滴加SF-1抗體試劑50 μL，37 ℃孵育100 min，Ultra沖洗緩沖液浸泡清洗2 min×3次；(6)滴加50 μL免疫雙染檢測試劑盒試劑2(即用型組合二抗，即HRP標記抗兔IgG+AP抗小鼠HRP)，37 ℃孵育30 min，Ultra沖洗緩沖液浸泡清洗2 min×3次；(7)滴加50 μL免疫雙染檢測試劑盒試劑3，室溫孵育10～15 min，Ultra沖洗緩沖液浸泡清洗2 min×3次；(8)滴加50 μL免疫雙染檢測試劑盒試劑4，室溫孵育5～10 min，自來水沖洗；(9)蘇木精染色液室溫染色0.5～1 min，自來水沖洗干凈，返藍晾干，切勿乙醇脫水；(10)透明、中性樹膠封固。

2 結果

2.1 臨床特征28例男性不育癥患者，平均年齡28歲(范圍24～39歲)。活檢前精液分析顯示23例(82%)精子計數為0(無精子癥)，其余5例(18%)為極罕見精子(少精子癥)。原發性不育癥23例(82%)，繼發性不育5例(18%)。臨床病史包括克氏綜合征6例(21%)，精索靜脈曲張7例(25%)，伴雙側隱睪史的促性腺功能低下2例(7%)，雙側附睪梗阻3例(11%)，既往睪丸炎2例(7%)，既往附睪炎3例(11%)。

2.2 病理檢查組織學診斷包含3例(11%)精子生成正常患者，7例(25%)精子生成低下患者，3例(11%)精原細胞成熟遲滯患者，14例(50%)唯支持細胞綜合征患者和1例(4%)伴廣泛生精小管玻璃樣變患者。所有活檢組織生精小管細胞按免疫組化雙染結果分為2種(表1)。(1)SF-1+/DOG1+：在正常精子發生(圖1)、精子生成不足(圖2)和成熟遲緩標本中(圖3)均呈雙重陽性；(2)SF-1+/DOG1-：在唯支持細胞綜合征中DOG1陰性，僅SF-1陽性(圖4)。根據免疫組化雙染結果顯示：在正常精子發生、精子生成不足和成熟遲緩這些病例中DOG1的陽性程度是由高到低的。

表1 不育癥的形態學特征及免疫表型

①A①B②A②B③A③B④A④B

3 討論

全世界不孕不育癥患者有6 000萬～8 000萬對夫婦，其中40%～50%的不孕是由男性因素造成的[4]。梗阻性無精子癥有時可以通過手術得到緩解，而在非梗阻性無精子癥患者中，如果沒有輔助生殖技術生育能力通常無法實現。從非梗阻性無精子癥患者睪丸成功取出精子的可能性取決于活檢的相關組織學類型。

盡管睪丸活檢很重要，但是病理醫師的診斷仍然存在顯著差異性，比如Cooperberg等[5]在重新檢查113例睪丸活檢切片中發現，原始診斷和重新檢查時的診斷之間的一致性僅為中等。因此，病理醫師對精子形成的質量和程度的評估，依賴于鮮明的細胞核著色和生精細胞結構的完整性這兩個形態學特征。遺憾的是，10%中性福爾馬林固定雖然可以更方便地固定標本，但睪丸活檢組織細胞的核著色相對較差，存在細胞收縮，細胞結構脫落的問題，因此僅依靠睪丸活檢的常規HE染色，病理醫師很難評估生殖細胞的成熟程度。Bouin固定液對細胞核著色鮮明，并保持精小管結構的完整性等優點，但是它會造成毒性和處理問題，因此，國內不常用[6-8]。

DOG1抗體最近被發現在生殖細胞中表達，特別是精原細胞和精子細胞。Osman等[9]研究發現雖然DOG1在精原細胞瘤中不著色，但它在正常輸精管中的精母細胞和精子細胞中表達。另Salama等[10]在2015年美國和加拿大病理學年會上發表的將DOG1免疫組化染色技術應用于40例不育癥睪丸活檢，發現精母細胞和精子細胞染色。利用Salama等的發現，結合SF-1在所有的激素樣細胞組織中的表達作用(特別是腎上腺皮質、睪丸支持細胞、間質細胞)[11]，本實驗設計了SF-1/DOG1免疫組化雙染法，用以鑒定患者的生殖細胞和支持細胞的形態學特征。

綜上所述，SF-1/DOG1免疫組化雙染對比常規HE染色可以更直觀的幫助病理醫師解釋福爾馬林固定睪丸活檢組織的形態學特征，并且可以從免疫組化雙染結果中獲益，幫助不育癥患者的分類，從而使患者和臨床醫師能夠更好地了解輔助生殖技術的后續使用情況。