熒光顯微技術與生命科學發現

衛紅萍 任衍鋼

（陽泉師范高等專科學校 山西陽泉 045200）

顯微成像技術的發展是生命科學的重要驅動力之一，其中，熒光顯微技術扮演著及其重要的角色[1]。依據2009 年《自然細胞生物學》（Nature Cell Biology）刊出《光學顯微鏡發展里程碑》的21項突破性進展中，至少有一半與熒光顯微技術密切相關。

1 熒光顯微技術的發明

熒光現象最早的描述被認為是16 世紀西班牙植物學家莫納德斯（Monardes）對軟質木質提取物熒光特性的報道。19 世紀早期研究發現，許多標本在紫外線照射下會發出熒光。1852 年，英國科學家斯托克斯（Stokes）在其出版的書中首創了“熒光”（fluorescence）一詞。1882 年，德國科學家埃爾利希（Ehrlich，1908 年諾貝爾生理學或醫學獎獲得者）首先用熒光染料——熒光素鈉確定眼睛中體液分泌的途徑，開啟了動物生理學使用熒光染料的先河。

早在19 世紀熒光方法就被應用，熒光顯微技術的發明則在20 世紀后。德國物理學家科勒（K?hler）受阿貝（Abbe）發現波長越短分辨率越高的啟發，于1904 年在德國耶拿的蔡司光學工廠制造了第1 臺紫外（UV）顯微鏡。科勒注意到，在紫外線照射下某些物體會發出較長波長的光——熒光。依據這種現象，德國物理學家海姆施塔特（Heimst?dt）于1911 年建造了第1 臺熒光顯微鏡[2]。但是，因最初對成像物體自身熒光的依賴，以及對透射光和暗場聚光鏡的需要限制了該顯微鏡的使用。

20 年后，奧地利的研究員海廷格（Haitinger）和其他科學家一起開發了二次熒光顯微技術。與第1 次熒光顯微技術不同的是，這次可將外源熒光化學物質應用于樣品，并創造了“熒光色素”術語。1929 年，德國藥理學家埃林格（Ellinger）和解剖學家赫特（Hirt）設計了第1 臺以紫外線為光源，使之發出熒光的落射熒光顯微鏡，并對注射熒光素和色氨酸的嚙齒類動物的腎臟和肝組織進行了觀察。1942 年，庫恩斯（Coons）用異硫氰酸熒光素標記抗體，標志著免疫熒光標記技術的誕生。1948 年，索爾茲曼（Saltzman）介紹了血液中水楊酸鹽的熒光分析方法[3]，開啟了熒光分析方法的先河。

2 熒光顯微技術的發展

20 世紀30 年代雖已發明了比光學顯微鏡分辨能力更強大的電子顯微鏡，但其仍無法觀察到活細胞的生理變化特征。光學顯微鏡雖可觀察動態生命，但會受到光學方面的限制。為此，科學家為克服光學顯微鏡中的難題進行了不斷的技術突破。主要體現在2 個方面：一是GFP（green fluorescent protein，簡稱GFP）的發現與應用，二是熒光顯微鏡的改進與應用。

2.1 GFP 的發現與應用

2.1.1 GFP 的發現 就生命科學而言，熒光顯微技術本身的意義在于提高顯微鏡的分辨能力，多年來科學家也從未間斷過尋找有效的熒光標本。GFP 的發現正是這方面具有里程碑意義的突破。1962 年的某一天，日本科學家下村修（Shimomura）在下班回家臨出門前關燈后發現：實驗室含有水母提取物——水母素的水池出現發光現象。由于水池也接受養魚缸的水，他先懷疑是魚缸成分影響了水母素，好奇心促使他繼續研究，結果發現是鈣離子增強了水母素發光。1963 年，下村修和約翰森（Johnson）在《科學》雜志報道鈣和水母素發光的關系。其后，里奇韋（Ridgway）和阿什利（Ashley）提出可用水母素檢測鈣濃度的方法。由于鈣離子是生物體內的重要信號分子，該方法對研究生命科學至關重要。

2.1.2 FRAP 和FRET 技術 GFP 在應用上需要解決的一個突出問題是，熒光圖像的衰減現象即光漂白影響了進一步觀察。直至1976 年，阿克斯羅德（Axelrod）等才找到了解決方法——光脫色熒光恢復技術（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP），這種技術首先被應用到細胞膜蛋白質的研究之中，它使研究人員能以微米級分辨率闡明細胞膜內和細胞膜間蛋白質的運動。隨著這些檢測技術的改進，使得單分子動力學的量化成為可能[4]。同時，GFP 應用上又產生了一個重大進展，費爾南德斯（Fernandez）和柏林（Berlin）首次表明，20 世紀40 年代由福斯特（F?rster）提出的熒光共振能量轉移（fluorescence/forster resonance energy transfer，FRET）理論可用于研究細胞表面受體復合物的動態分布。因為與標準熒光標記相比，它促進了更高空間分辨率的受體分布測定，并利用熒光顯微鏡繪制高分辨率活細胞中的蛋白質分布和相互作用[5]。FRET 特別適合于細胞中蛋白質-蛋白質相互作用的成像，因為要在FRET 信號中觀察到變化，2 個熒光團必須非常接近。這些技術都為GFP 可視化探針的發現奠定了基礎。

2.1.3 GFP 可視化探針 隨著熒光顯微技術上的改進，1993 年，巴克斯凱（Bacskai）和華裔美籍科學家錢永健等應用先進的激光共聚焦熒光顯微鏡和FRET 等技術，首先觀察到了海兔（Aplysia）感官神經元在5-羥色胺刺激下環腺苷酸依賴性蛋白激酶催化亞基和調節亞基及游離cAMP 的變化。次年，錢永健又在實驗室改良了多個GFP 變種，它們中有的熒光更強、更亮，有的呈黃色、藍色，有的可激活、可變色，有的更穩定、更易激發。這使成像實驗能跟蹤細胞和生物體中的多個標記蛋白成為可能。同時，查爾菲（Chalfie）等在《科學》雜志發表的一篇報告中顯示，維多利亞水母的GFP 可作為蛋白質定位和在活細菌及蠕蟲細胞中表達的標記物，這樣可將GFP 用于研究體內蛋白。GFP 作為體內蛋白質可視化探針的發現，為更復雜的顯微技術奠定了基礎。2008 年，下村修、查爾菲和錢永健因這方面杰出的工作分享了諾貝爾化學獎。

2.1.4 熒光雙重標記實驗 隨著GFP 可視化探針的應用，宮崎駿（Miyawaki）等意識到GFP 及其他顏色的熒光蛋白雖具有高亮度和極好的光穩定性，但若能找到一些能變化和轉化的熒光蛋白才會更清晰地分辨不同蛋白的作用。為此，他們在1997 年成功地構建了一個編碼藍色GFP 的CaM 和肌球蛋白輕鏈激酶（M13）的CaM 結合肽與綠色GFP 的構建體。這就如同不僅要給細胞內不同的蛋白分子穿上不同顏色的“服裝”，而且還能觀察其在活動中的相互結合及色彩或強度變化[6]。1999 年，馬茨（Matz）等則進一步提出了類GFP 蛋白的熒光性質不一定都與發光生物有關的解釋，并發現非生物發光的珊瑚礁同樣呈現明亮的熒光顏色。這導致了熒光技術的首次雙重標記實驗，即將克隆的紅色熒光蛋白或綠色變異體注射到非洲爪蟾胚胎的胚泡中，結果發現在蝌蚪期標記有單個蛋白質（紅色或綠色）或2個蛋白質（黃色）的區域。2000 年，扎科洛（Zaccolo）等發現FRET 可測量蛋白質之間的相互作用。他們發現對cAMP 的生理刺激可導致FRET 的丟失，用這種生物傳感器可檢測cAMP 水平的生理變化。正是這些不斷創新的方法，2003 年，美國科學家里德（Rieder）等觀察到了活細胞的有絲分裂過程[7]。

2.2 熒光顯微鏡的改進與應用

2.2.1 激光共聚焦熒光顯微成像 除了GFP 的發現和應用外，激光顯微鏡的改進及技術同樣功不可沒。首先是激光共聚焦顯微鏡的發明與應用。普通熒光顯微鏡使用中存在的問題之一是：放大至一定倍數后，會因失焦信息干擾導致分辨率衰減。在20 世紀60 年代，為消除這種現象，美國和捷克斯洛伐克的科學家應用1957 年由美國科學家即人工智能之父明斯基（Minsky）注冊的專利技術原理，制造出共聚焦顯微鏡。但20 世紀80年代前，觀察相對較厚標本存在技術上的困難，共聚焦顯微鏡的應用還十分有限[8]。1982 年，蔡司公司推出了能利用振蕩激光束和電子圖像處理進行物體掃描的激光共聚焦掃描顯微鏡，可從多個光學視角拆解較厚、較大檢測樣本。這如同盲人摸象一樣，需要對多個掃面點綜合。1987 年發表的2 篇論文開啟了激光共聚焦顯微鏡在細胞生物學中的第1 個關鍵應用。其中一篇是德國海德堡歐洲分子生物學凱西門（Kai Simon）實驗室用熒光神經酰胺標記跟蹤新合成的鞘脂在上皮細胞中的轉運，清晰地觀察到該亞細胞過程[9]。到20 世紀80 年代末，激光共聚焦顯微成像成為標準的熒光顯微技術。1990 年，在激光掃描共聚焦顯微鏡的基礎上，又誕生了可進行長期的活體細胞成像（例如，腦）和深部組織成像的雙光子熒光顯微鏡。

2.2.2 反卷積算法 由于光通過某種介質時會發生彎曲，導致光學顯微鏡圖像混濁和模糊。1983 年，科學家在使用瓊脂和鎮靜劑時找到了一種解決辦法——反卷積算法（deconvolution algorithms）。它利用顯微鏡光學特性的知識模擬成像過程，在幾輪迭代計算中，將對象的估計值輸入方程，并將計算結果與原始圖像進行比較，以改進估計值，直至確定對象的真實屬性。用這種方法首次獲得了用熒光標記黑腹果蠅唾液腺細胞核內染色質結構和組織的高分辨率圖像。1989年，費伊（Fay）及其同事用熒光標記平滑肌中蛋白質的研究中又取得了另一個關鍵進展，解決了反卷積算法可放大圖像中的噪聲使得很難縮小估計范圍以確定真實物體的問題。這樣產生的高分辨率圖像，能定量分析平滑肌細胞中α-肌動蛋白的分布[10]。

2.2.3 超分辨率熒光顯微鏡 幾乎就在人們熱衷于研究GFP 技術的同時，另一項與GFP 相關的技術也出現了重大突破。這就是突破了光學上的衍射極限屏障即傳統的光學顯微鏡（也稱為遠場光學顯微鏡）無法分辨150～200 nm 以下的物體。由于許多細胞過程發生在這個長度范圍為數十到數百納米的衍射極限距離內，傳統的光學顯微鏡在達到最大理論分辨率后，無法進一步可視化。如何克服光學顯微鏡的衍射極限？

1990 年，正攻讀博士學位的羅馬尼亞出生的科學家黑爾（Hell）發現，若不是像常規那樣使用1個透鏡聚焦，而是將2 個大孔徑的透鏡組合在一起聚焦可突破這個極限，從而提高光學顯微鏡的分辨率。1993 年某天早晨，黑爾正在看一本有關光學量子理論的書，忽然靈感在他的腦海里浮現：用一束鐳射激發熒光分子發光，用另一束鐳射消除所有“大尺寸”物體的熒光。即通過運用2束鐳射掃描樣品，就可呈現出尺寸小于0.2 μm 的分辨圖，突破權威認定的衍射極限屏障。經多次失敗后，他制作了受激發射損耗顯微鏡（stimulated emission depletion，STED）。1994 年，黑爾在《光學快報》（Optics Letters）上發表了關于STED 的理論文章。但黑爾的工作曾經受到質疑，1999 年，他投給《自然》和《科學》雜志的研究成果均被退稿。直至2000 年，《美國國家科學院院刊》（PNAS）發表了黑爾的科研成果。黑爾被認為是首次得到了納米級的熒光圖像并將顯微技術帶入“納米”領域的科學家。與此同時，1993 年，貝茲（Betzig）和奇切斯特（Chichester）首次報道了在室溫下用近場掃描光學顯微鏡（NSOM）新技術對單個熒光團進行重復成像，并于1995年提出了單分子定位概念，開創了單分子成像的先河。1995 年，柳田（Yanagida）等使用優化的全內反射熒光顯微鏡實現了1個熒光團標記的ATP分子與肌球蛋白分子的相互作用，實現了單分子技術在生物系統中的首次應用，達到了能“親眼目睹”活細胞內單個分子的動態化[11]。1997 年，莫爾納（Moerner）在曾經開創了單分子檢測及成像的基礎上，又發現了光調控綠色熒光蛋白發光的方法，該方法成為光激活成像（PALM）等超分辨熒光成像方法的基礎。這一重大發現，使貝茲等在2006年用熒光蛋白目睹了突破“阿貝分辨率”約10 倍（2～25 nm）的溶酶體和線粒體圖像[12]。這些杰出的貢獻，使黑爾、貝茲和莫爾納共同分享了2014年的諾貝爾化學獎。

綜上所述，在細胞生物學的發展中，熒光顯微技術扮演了重要角色。正如著名的物理學家弗里曼（Freeman）所言：每次我們引進一種新的工具，總會帶來意想不到的新發現,大自然的想象力比我們豐富。