乳腺癌CTC與病理特征及預(yù)后相關(guān)性分析

阮國(guó)棟 王華 李志安

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有侵襲性、難治愈且易復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命。我國(guó)乳腺癌發(fā)病率的增長(zhǎng)速度非?？?、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，乳腺癌的診斷和治療依舊是一個(gè)研究熱點(diǎn)［1］。影像學(xué)結(jié)合病理學(xué)檢查是目前臨床檢測(cè)乳腺癌的主要手段，檢測(cè)方法均具有創(chuàng)傷性和重復(fù)性低的特點(diǎn)，且在腫瘤達(dá)到特定大小或已發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)才能檢測(cè)到，易錯(cuò)過(guò)最佳治療期。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cell，CTC）檢測(cè)技術(shù)是一種實(shí)時(shí)無(wú)創(chuàng)的腫瘤診斷方法，操作簡(jiǎn)單，具有可重復(fù)性，已被用于包括乳腺癌在內(nèi)的多個(gè)癌種的臨床診斷［2-3］。在影像學(xué)發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶之前，CTC 檢測(cè)將成為檢測(cè)乳腺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后過(guò)程的有力工具。本資料將循環(huán)腫瘤細(xì)胞與乳腺癌的分期、分子分型進(jìn)行綜合研究，研究乳腺癌 CTC 的表達(dá)水平與患者臨床病理特征以及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集于2016年1～5月期間在本院就診的68例乳腺癌患者的臨床資料，年齡48～80歲，平均（64.3±16.4）歲。腫瘤直徑≥5cm者7例，＜5cm者61例；人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）陽(yáng)性12例，HER-2陰性56例；TNM分期為Ⅰ～Ⅲ期，Ⅰ期21例，Ⅱ期33例，Ⅲ期14例；乳腺癌分子分型，Luminal A型9例，Luminal B型40例，HER-2過(guò)表達(dá)型10例，三陰型 9例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)穿刺活檢技術(shù)確診為乳腺癌；（2）均為初診患者，且腫瘤為單側(cè)、單發(fā)；（3）TNM分期為Ⅰ～Ⅲ期，臨床干預(yù)手段為手術(shù)治療結(jié)合化療；（4）無(wú)其他部位惡性腫瘤；（5）無(wú)炎癥性乳腺癌、哺乳期乳腺癌或已行包塊切除活組織檢查。隨訪：從第1次診療后開(kāi)始，以電話(huà)形式每隔 3 個(gè)月隨訪1次，共隨訪4年。達(dá)到隨訪時(shí)間、患者意外死亡或失聯(lián)后終止隨訪。

1.2 CTC檢測(cè)方法在手術(shù)后化療前24h、輔助化療結(jié)束后24h使用BD采血管采集患者的外周血液樣本2份，每份7.5ml，室溫保存并于24h內(nèi)處理。室溫條件下800g離心8min，棄掉上層血漿，保留至細(xì)胞層上5mm處。去除紅細(xì)胞向離心管中加入3ml專(zhuān)用的密度梯度離心分離介質(zhì)，緩沖液去除血漿的血樣稀釋后，緩慢平鋪于離心介質(zhì)上方。1050g離心8min。離心后緩慢取出采血管，將含白膜層的上層分離液全部轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的離心管。于上述去除紅細(xì)胞的細(xì)胞懸液中加入適量的抗CD45的免疫磁顆粒，室溫條件下孵育30～60min。將免疫磁珠孵育后的樣本置于磁場(chǎng)下孵育5min，再將全部未結(jié)合磁珠的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的離心管，則該離心管中的細(xì)胞為去除了絕大多數(shù)紅細(xì)胞和白細(xì)胞的非血源性細(xì)胞。然后將富集后的細(xì)胞懸液，體積調(diào)整至100μl，加入同等體積的細(xì)胞固定液。緩慢吹打混勻后均勻涂于專(zhuān)用細(xì)胞防脫載玻片，于32℃過(guò)夜烘干。細(xì)胞涂片經(jīng)潤(rùn)洗后，用CEP8探針進(jìn)行原位熒光雜交，加入200μl 緩沖液配制的抗體（CD45-Alexa fluor 594，CK18）室溫避光孵育2h，并用DAPI 熒光保存液封片，于正置熒光顯微鏡中立即觀察細(xì)胞。根據(jù)CTC判讀標(biāo)準(zhǔn)判定CTC細(xì)胞（CTC：DAPI+/CD45-/CEP8+，DAPI+/CD45-/CK+；WBC：DAPI+//CD45+/CEP8-/CK-）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以n或%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。生存分析比較采用Mantel-Cox檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTC細(xì)胞鑒定 利用基于淋巴細(xì)胞表面抗原的CD45免疫磁珠進(jìn)行外周血CTC的陰性富集，結(jié)合免疫熒光染色和原位熒光雜交（FISH）技術(shù)進(jìn)行乳腺癌CTC的鑒定。將DAPI+/CD45-/CEP8+和DAPI+/CD45-/CK+判定為CTC細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

2.2 CTC與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 CTC與乳腺癌病理特征關(guān)系如表1所示，腫瘤直徑＞5cm的患者與直徑＜5cm患者相比中更易檢測(cè)出CTCs陽(yáng)性（P＜0.05）。乳腺癌患者CTC陽(yáng)性率與腫瘤TNM分期顯著相關(guān)（P＜0.05），TNM分期為Ⅰ期CTCs陽(yáng)性率為16.7%，Ⅲ期為45.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同年齡、不同乳腺癌分子分型及HER-2表達(dá)與CTCs陽(yáng)性無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。

表1 CTC與乳腺癌病理特征的關(guān)系［n（%）］

2.3 預(yù)后生存分析 根據(jù)患者化療前CTC陽(yáng)性情況，將乳腺癌患者分為CTC陽(yáng)性組44例，CTC陰性組24例。其中CTC陽(yáng)性組48個(gè)月生存率為37.12%，CTC陰性組48個(gè)月生存率為60.12%，CTC陽(yáng)性組48個(gè)月生存率低于CTC陰性組48個(gè)月生存率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖 2。

圖2 CTC 陽(yáng)性和CTC 陰性患者生存曲線(xiàn)圖

2.4 乳腺癌患者化療前后CTC檢測(cè)情況 化療前68例乳腺癌患者中CTC陽(yáng)性率為35.3%（24/68），化療后CTC陽(yáng)性率顯著下降為19.1%（13/68），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

乳腺癌發(fā)病率現(xiàn)居女性惡性腫瘤首位，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)［4］。已有研究證實(shí)，CTC 對(duì)判斷早期乳腺癌及轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的預(yù)后均具有重要價(jià)值。常見(jiàn)CTC的富集包括流式細(xì)胞分選法、密度梯度離心法、膜過(guò)濾法和免疫磁珠富集法。由于膜過(guò)濾法和免疫磁珠分離方法的準(zhǔn)確性較高并且無(wú)需較大樣本量，因而在CTC檢測(cè)中的應(yīng)用更為廣泛。基于淋巴細(xì)胞標(biāo)志物CD45的免疫磁珠陰性富集的方法，靈敏性較高，對(duì)后續(xù)CTC鑒定所使用表面標(biāo)志物的選擇更為靈活。CTC陰性富集之后，利用CD45、CK染色和FISH檢測(cè)實(shí)現(xiàn)CTCs的鑒定和分型。本資料中采用免疫磁珠分析方法分離CTC，將DAPI+/CD45-/CEP8+和DAPI+/CD45-/CK+判定為CTC細(xì)胞，在手術(shù)放化療前，檢測(cè)到24例患者CTC表達(dá)呈陽(yáng)性，44例CTC表達(dá)呈陰性。

本資料結(jié)果中CTC陽(yáng)性患者4年生存率為37.12%，CTC陰性患者為60.12%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此結(jié)果與梁志洪等應(yīng)用膜過(guò)濾法檢測(cè)CTC在乳腺癌預(yù)后與化療評(píng)估中的結(jié)果相一致［4］。因此，本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了CTC陽(yáng)性患者生存期短，可用于預(yù)估乳腺癌患者預(yù)期生存率。進(jìn)一步分析了CTC檢出情況與病理的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者CTC陽(yáng)性率與腫瘤直徑大小及腫瘤TNM分期顯著相關(guān)（P＜0.05）。腫瘤直徑＞5cm的患者與直徑＜5cm患者相比中更易檢測(cè)出CTCs陽(yáng)性（P＜0.05）。TNM分期為Ⅰ期CTCs陽(yáng)性率為16.7%，Ⅲ期為45.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而與患者年齡、乳腺癌分子分型及HER-2表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。因此認(rèn)為HER-2陽(yáng)性的乳腺癌患者不一定會(huì)檢出CTC陽(yáng)性，這與Ligthart等［5］報(bào)道相一致，該報(bào)道中HER-2陽(yáng)性患者中29%呈現(xiàn)CTC陰性。本資料中68例乳腺癌患者化療前CTC陽(yáng)性率為35.3%，化療后CTC陽(yáng)性率顯著下降為19.1%（P＜0.05）。此結(jié)果與江秋晨等［6］結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)CTC檢測(cè)可用于化療期間療效監(jiān)測(cè)，還可用于評(píng)估化療療效及生存時(shí)間預(yù)測(cè)。

因此，對(duì)于治療前CTC陽(yáng)性而治療后仍陽(yáng)性的患者，可考慮適當(dāng)強(qiáng)化化療方案，也可作為對(duì)于HR陽(yáng)性患者延長(zhǎng)內(nèi)分泌治療的一個(gè)考量指標(biāo)。同時(shí)本文樣本量小，需要前瞻性、大樣本、多中心的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。